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Comunitária

Regulamento (CEE) n.º 2676/90 da Comissão, de 17 de Setembro de 1990

Regulamento (CEE) n.º 2676/90 da Comissão, de 17 de Setembro de 1990


Regulamento (CEE) n.º 2676/90 da Comissão de 17 de Setembro de 1990, que determina os métodos de análise comunitários aplicáveis no sector do vinho...
Jornal oficial no. L 272 de 03/10/1990 P. 0001 - 0192

Alterações posteriores:
Alterado por 391R2348 (JO L 214 02.08.91 p.39)
Retomado por 294A0103(48) (JO L 001 03.01.94 p.210)
Alterado por 396R0069 (JO L 014 19.01.96 p.13)
Alterado por 397R0822 (JO L 117 07.05.97 p.10)

Texto:

REGULAMENTO (CEE) N.º 2676/90 DA COMISSÃO de 17 de Setembro de 1990 que determina os métodos de análise comunitários aplicáveis no sector do vinho

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CEE) n.º 822/87 do Conselho, de 16 de Março de 1987, que estabelece a organização comum do mercado vitivinícola (1), alterado pelo Regulamento (CEE) n.º 1325/90 (2), e, nomeadamente, o seu artigo 4.º,

Considerando que o n.º 1 do artigo 74.º do Regulamento (CEE) n.º 822/87 determina a adopção dos métodos de análise que permitem estabelecer a composição dos produtos referidos no artigo 1.º desse regulamento e as regras que permitem estabelecer se esses produtos foram objecto de tratamento com violação das práticas enológicas autorizadas;

Considerando que, uma vez que a Comunidade ainda não estabeleceu os teores-limite dos elementos presentes que caracterizam a utilização de certas práticas nem quadros que permitam a comparação dos dados analíticos, é conveniente autorizar os Estados-membros a determinar os limites;

Considerando que o n.º 1 do artigo 13.º do Regulamento (CEE) n.º 822/87 prevê um exame analítico respeitante aos valores mínimos dos elementos característicos dos vqprd em causa, que figuram entre os enumerados no anexo do referido regulamento;

Considerando que o controlo das indicações que constam dos documentos relativos aos produtos em causa torna necessária a implementação de métodos de análise uniformes que assegurem a obtenção de dados precisos e comparáveis; que, por consequência, estes métodos devem ser obrigatórios em qualquer transacção comercial ou em qualquer operação de controlo e, dadas as possibilidades limitadas do comércio, é conveniente admitir um número limitado de processos usuais que permitam uma determinação rápida e suficientemente segura dos elementos pesquisados;

Considerando que é útil reter como métodos, na medida do possível, aqueles que beneficiam do reconhecimento geral, tais como os métodos desenvolvidos no âmbito da Convenção Internacional para a Unificação dos Métodos de Análise e a Aplicação dos Vinhos de 1954, publicados pelo «Office International de la Vigne et du Vin» na Colectânea dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos (Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins);

Considerando que o Regulamento (CEE) n.º 1108/82 (3) estabelece métodos de análise comunitários aplicáveis no sector do vinho; que, tendo em conta o progresso científico, se tornou necessário substituir determinados métodos por métodos mais adequados, alterar alguns métodos e introduzir outros, nomeadamente aqueles que foram desde há muito aprovados pelo «Office International de la Vigne et du Vin»; que devido ao grande número e à complexidade destas adaptações, é conveniente agrupar todas as análises num novo regulamento e revogar o Regulamento (CEE) n.º 1108/82;

Considerando que, para assegurar a comparabilidade dos resultados obtidos na aplicação dos métodos de análise mencionados no artigo 74.º do Regulamento (CEE) n.º 822/87, convém que se refira, no que respeita à exactidão, repetibilidade e reprodutividade desses resultados, às definições estabelecidas pelo «Office International de la Vigne et du Vin»;

Considerando que, tendo em conta todo o progresso científico, por um lado, e o equipamento técnico dos laboratórios oficiais, pelo outro, e com o objectivo de tornar o trabalho destes laboratórios mais eficaz e mais rentável, há lugar para permitir a aplicação de métodos de análise automatizados sob determinadas condições; convém especificar que, em caso de litígio, os métodos automatizados não podem substituir os métodos de referência nem os métodos usuais;

Considerando que os resultados de uma medição da densidade pelo método automatizado baseado no princípio de um ressonador de flexão são, no que respeita à exactidão, à sua repetibilidade e reprodutibilidade, pelo menos iguais aos resultados obtidos pelos métodos constantes do ponto 1 do anexo do presente regulamento para medir a massa volúmica ou a densidade relativa; que é, portanto, indicado, em virtude do n.º 3 do artigo 74.º do Regulamento (CEE) n.º 822/87, considerar este método automatizado como equivalente aos métodos referidos, constantes do anexo do presente regulamento;

Considerando que o método operatório, descrito no ponto 2.2.3.3.2 do capítulo 25 do anexo do presente regulamento para análise do teor de dióxido de enxofre total dos vinhos e dos mostos com um teor presumido de menos de 50 miligramas por litro, leva a uma melhor extracção daquela substância relativamente ao modo operatório descrito no ponto 13.4 do capítulo 13 do anexo do Regulamento (CEE) n.º 1108/82; que deste facto resultam teores mais elevados de dióxido de enxofre total dos produtos analisados que podem exceder, nomeadamente no caso de determinados sumos de uva, o limite máximo prescrito; que, a fim de evitar dificuldades para o escoamento dos sumos de uva já elaborados aquando da entrada em vigor do presente regulamento e enquanto se aguarda que os processos de elaboração sejam adaptados para levar a uma dessulfitação mais completa dos mostos de uva amuados, há que permitir, durante um período transitório, que o modo operatório descrito no regulamento atrás referido seja ainda utilizado;

Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão dos Vinhos,
ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1.º

1. Os métodos de análise comunitários aplicáveis no sector do vinho que, aquando das transacções comerciais e de toda a operação de controlo, permitem:

- estabelecer a composição dos produtos referidos no artigo 1.º do Regulamento (CEE) n.º 822/87,
- estabelecer se estes produtos foram objecto de tratamentos que violam as práticas enológicas autorizadas,
são os que figuram no anexo do presente regulamento.

2. Para as matérias para as quais os métodos de referência e os métodos usuais estão fixados, prevalecem os resultados obtidos por aplicação dos métodos de referência.

Artigo 2.º

Para efeitos de aplicação do presente regulamento:

a) A repetibilidade representa o valor abaixo do qual se situa, com uma probabilidade específica, o valor absoluto da diferença dos dois resultados individuais obtidos a partir de medidas efectuadas nas mesmas condições (mesmo operador, mesmo aparelho, mesmo laboratório e num curto espaço de tempo);

b) A reprodutividade representa o valor abaixo do qual se situa, com uma probabilidade específica, o valor absoluto da diferença de dois resultados individuais obtidos em condições diferentes (operadores diferentes, aparelhos diferentes, e/ou laboratórios diferentes e/ou épocas diferentes).

O termo «resultado individual» é o valor obtido quando se aplica, uma vez e completamente, o método de ensaio normalizado a uma única amostra.

Na ausência de indicação, a probabilidade é de 95 %.

Artigo 3.º

1. São admitidos métodos de análise automatizados, sob a responsabilidade do director do laboratório, desde que a exactidão, a repetibilidade e a reprodutividade dos resultados sejam pelo menos equivalentes às dos resultados obtidos com os métodos de análise constantes do anexo.

Em caso de litígio, os métodos constantes do anexo não podem ser substituídos pelos métodos automatizados.

2. O método automatizado para medição da densidade, baseado no princípio de um ressonador de flexão é considerado equivalente ao método constante no ponto 1 do anexo do presente regulamento.

Artigo 4.º

Quando for feita referência à água para soluções, diluições ou lavagens, trata-se de água destilada ou de água desmineralizada de pureza pelo menos equivalente. Todos os produtos químicos devem, salvo especificação em contrário, ser de qualidade analítica.

Artigo 5.º

Fica revogado o Regulamento (CEE) n.º 1108/82.

Todavia o n.º 4 do artigo 1.º do referido regulamento continua em vigor até 31 de Dezembro de 1990.

Artigo 6.º

O presente regulamento entra em vigor na data da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.
É aplicável a partir de 1 de Outubro de 1990.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.

Feito em Bruxelas, em 17 de Setembro de 1990.

Pela ComissãoRay MAC SHARRYMembro da Comissão

Nota: Os quadros, os diagramas e uma parte das figuras que constam do anexo foram postos à disposição da Comissão das Comunidades Europeias pelo «Office International de la Vigne et du Vin», de Paris.

(1)JO no L 84 de 27. 3. 1987,p. 1. (2)JO no L 132 de 23. 5. 1990,p. 19. (3)JO no L 133 de 14. 5. 1982,p. 1.

ANEXO

1. MASSA VOLÚMICA A 20 °C E DENSIDADE RELATIVA A 20 °C 1. DEFINIÇÕES

A massa volúmica é o quociente entre a massa de um determinado volume de vinho ou de mosto a 20 °C e esse volume. Exprime-se em gramas por mililitro e o seu símbolo é 20 °C.

A densidade relativa a 20 °C ou densidade 20 °C/20 °C é a razão, expressa em número decimal, entre a massa dum certo volume de vinho ou de mosto a 20 °C e a massa do mesmo volume de água à mesma temperatura. O seu símbolo é
d20 °C20 °C.

2. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS

A massa volúmica e a densidade relativa a 20 °C são determinadas na amostra por ensaio:

quer por picnometria: método de referência,

quer por areometria ou densimetria por balança hidrostática:

métodos usuais.

Nota: Para determinações muito precisas, a massa volúmica deve ser corrigida da acção do dióxido de enxofre

r20 °C = r2 20 °C 0,0006 · S,r20 °C = massa volúmica corrigida,r220 °C = massa volúmica observada,S = dióxido de enxofre total g/l.

3. TRATAMENTO PRÉVIO DA AMOSTRA

Se o vinho ou o mosto contêm quantidades notáveis de dióxido de carbono, expulsar a maior quantidade possível por agitação de 250 ml de vinho num frasco de 1 000 ml ou por filtração sob pressão reduzida sobre 2 g de algodão colocado numa alonga.

4. MÉTODO DE REFERÊNCIA

4.1. AparelhagemMaterial corrente de laboratório e, nomeadamente:

4.1.1. Picnómetro (1), em vidro pyrex, com uma capacidade de cerca de 100 ml, com um termómetro móvel com polidura de esmeril, graduado em décimos de grau de 10° a 30 °C. Este termómetro deve ser controlado (ver figura 1).

Figura 1 Picnómetro e seu frasco-tara

Este picnómetro dispõe de um tubo lateral de 25 mm de comprimento, com um diâmetro interno máximo de 1 mm, terminado por uma parte cónica esmerilada. Este tubo lateral pode ter uma «rolha receptora» constituída por um tubo cónico esmerilado terminado por uma parte afilada. Esta rolha serve de câmara de dilatação.

As duas esmerilagens do aparelho devem ser feitas com muito cuidado.

4.1.2. Frasco-tara com o mesmo volume externo (a menos de 1 ml aproximadamente) que o picnómetro e de massa igual à massa do picnómetro cheio com um líquido de densidade 1,01 (solução a 2 % (m/v) de cloreto de sódio).

Recipiente envolvente tornado calorífugo que se adapte exactamente ao corpo do picnómetro.

4.1.3. Balança de dois pratos com capacidade de pelo menos 300 g, sensível à décima de miligramãouBalança de prato único com capacidade de pelo menos 200 g, sensível à décima de miligrama.

4.2. Calibração do picnómetro

A calibração do picnómetro inclui a determinação das seguintes características:
- tara quando vazio,
- volume a 20 °C,
- massa de água a 20 °C.

4.2.1. Utilização de uma balança de dois pratos

Depois de colocar o frasco-tara no prato esquerdo da balança e o picnómetro, limpo, seco e munido da respectiva «rolha receptora», no prato direito, obter o equilíbrio colocando ao lado do picnómetro massas marcadas: sendo p gramas.

Encher o picnómetro, cuidadosamente, com água destilada à temperatura ambiente e introduzir o termómetro; enxugar cuidadosamente o picnómetro e colocá-lo no recipiente calorífugo; agitar por viragem até que a temperatura lida no termómetro seja constante. Nivelar exactamente pelo bordo superior do tubo lateral. Enxugar este tubo lateral, colocar a rolha receptora; ler a temperatura t °C com cuidado e corrigi-la, eventualmente, da inexactidão da escala do termómetro. Pesar o picnómetro cheio de água, seja p2 a massa em gramas que origina o equilíbrio.

Cálculos (2)

Tara do picnómetro vazio:Tara quando vazio = p + mm = massa de ar contido no picnómetrom = 0,0012 (p p2).

Volume a 20 °C:V20 °C = (p + m p2) · FtFt = factor constante da tabela I para a temperatura t °CV20 °C deve ser conhecido com uma aproximação de ± 0,001 ml.

Massa de água a 20 °C:M20 °C = V20 °C· 0,9982030,998203 = massa volúmica a 20 °C.

4.2.2. Utilização de uma balança de prato único

Determinar:
- a massa do picnómetro limpo e seco: P,
- a massa do picnómetro cheio de água a t °C: P1 seguindo as indicações descritas em 4.2.1.,
- a massa do frasco tara To.

Cálculos (3)

Tara do picnómetro vazio:Tara quando vazio: P mm = massa de ar existente no picnómetrom = 0,0012 (P1 P).

Volume a 20 °CV20 °C = [P1 (P m)] · FtFt = factor constante da tabela I para a temperatura t °C.O volume a 20 °C deve ser conhecido com uma aproximação de ± 0,001 ml.

Massa de água a 20 °C:M20 °C = V20 °C · 0,9982030,998203 = massa volúmica da água a 20 °C.4.3. Técnica de uma medição (3)

4.3.1. Utilização de uma balança de dois pratos

Pesar o picnómetro cheio com a amostra preparada para ensaios, (3) segundo as indicações descritas em 4.2.1., seja p" a massa em gramas que origina o equilíbrio a t °C.

Massa do líquido contido no picnómetro = p + m p".

Massa volúmica aparente a t °C:

Calcular a massa volúmica a 20 °C por meio de uma das tabelas de correcção seguintes, consoante a natureza do líquido estudado: vinho seco (tabela II), mosto natural ou concentrado (tabela III), vinho doce (tabela IV).

Exprime-se a densidade 20 °C/20 °C do vinho dividindo a massa volúmica a 20 °C por 0,998203.4.3.2. Utilização de uma balança de prato único (3)

Pesar o frasco-tara, sendo T1 a sua massaCalcular dT = T1 - ToMassa do picnómetro vazio no momento da medição = P - m + dT.

Pesar o picnómetro cheio com a amostra preparada para ensaios (3) seguindo as indicações descritas em 4.2.1. ou seja P2 a massa a t °C.

Massa do líquido contido no picnómetro a t°C = P2 - (P - m + dT).

Massa volúmica aparente a t °C:

Calcular a massa volúmica a 20°C do líquido estudado: vinho seco, mosto natural e concentrado, vinho doce, como é indicado em 4.3.1.

A densidade 20 °C/ 20 °C é obtida dividindo a massa volúmica a 20 °C por 0,998203.

Repetibilidade da massa volúmica:para os vinhos secos e macios: r = 0,00010, para os vinhos doces: r = 0,00018.

4.3.4. Reprodutibilidade da massa volúmica:para os vinhos secos e adamados: R = 0,00037,para os vinhos doces: R = 0,00045.

5. MÉTODOS USUAIS

5.1. Areometria

5.1.1. Aparelhagem

5.1.1.1. Areómetro

Os areómetros devem responder às prescrições da ISO no que diz respeito à suas dimensões e graduações.

Devem ter um carena cilíndrica, uma haste de secção circular de, pelo menos, 3 mm de diâmetro. Para os vinhos secos, devem ser graduados de 0,983 a 1,003 por milésimo e quinto de milésimo. Cada milésimo deve ser separado por, pelo menos, 5 mm do milésimo seguinte. Para a medição da densidade dos vinhos desalcoolizados, dos vinhos doces e dos mostos, utiliza-se um jogo de 5 aerómetros graduados de 1,000 - 1,030; - 1,030 - 1,060; 1,060 - 1,090; 1,090 - 1,120; 1,120 - 1,150. Estes aparelhos são graduados em massas volúmicas a 20 °C por milésimo e meio milésimo, pelo menos, sendo cada milésimo separado por, pelo menos, 3 mm do milésimo seguinte.

Estes areómetros devem ser graduados de modo a que a leitura seja feita pelo «cimo do menisco». A indicação da graduação em massa volúmica a 20 °C ou em densidade relativa a 20 °C e da leitura ao nível do cimo do menisco é inscrita quer na escala graduada quer numa banda de papel existente dentro de carena.

Estes aparelhos devem ser controlados por um serviço oficial.

5.1.1.2. Termómetro controlado graduado em, pelo menos, meios graus Celsius.

5.1.1.3. Proveta cilíndrica de 36 mm de diâmetro interno e de 320 mm de altura, mantida verticalmente por meio de um suporte de roscas de nivelamento.

5.1.2. Modo operatório

Técnica de medição

Na proveta (5.1.1.3) colocar 250 ml da amostra preparada para ensaios (3) e introduzir o areómetro e o termómetro. Ler o termómetro um minuto depois de ter agitado para obter o equilíbrio de temperatura. Retirar o termómetro e ler a massa volúmica aparente a t °C na escala do areómetro após um minuto de repouso.

Corrigir a massa volúmica aparente lida a t °C da acção da temperatura por meio de tabelas que se aplicam aos casos dos vinhos secos (tabela V), dos mostos (tabela VI) e dos vinhos que contêm açúcar (tabela VII).

A densidade 20 °C/20 °C é obtida dividindo a massa volúmica a 20 °C por 0,998203.

5.2. Densimetria por balança hidrostática.

5.2.1. Aparelhagem

Balança hidrostática

Balança hidrostática, cuja capacidade máxima seja, pelo menos, de 100 g, sensível a 1/10 de mg.

Em cada prato é fixado um flutuador em vidro pyrex, com um volume de, pelo menos, 20 ml. Estes dois flutuadores idênticos são suspensos por um fio de diâmetro inferior ou igual a 0,1 mm.

O flutuador suspenso no prato direito deve poder ser introduzido numa proveta cilíndrica com um indicador de nível. Esta proveta deve ter um diâmetro interno superior ao flutuador em, pelo menos, 6 mm. Este último deve caber inteiramente no volume da proveta situado abaixo do indicador, devendo a superfície do líquido a medir ser apenas atravessada pelo fio de suspensão. A temperatura do líquido contido na proveta é medida por um termómetro graduado em 1/5 de grau.

Pode também utilizar-se uma balança hidrostática de prato único.

5.2.2. Modo operatório

5.2.2.1. Calibração de uma balança hidrostática

Com os dois flutuadores no ar, estabelecer o equilíbrio colocando no prato direito massas marcadas p.

Encher a proveta de água pura até ao indicador, ler a temperatura t °C após agitação e repouso de 2 ou 3 min.Restabelecer o equilíbrio por meio das massas marcadas colocadas no prato da direita, ou seja p' essas massas.

Volume do flutuador a 20 °C:V20 °C = (p2 - p) (F + 0,0012).F = factor dado pela tabela I para a temperatura t °C.
p e V20 são as características do flutuador.

5.2.2.2. Técnica de uma medição

O flutuador da direita é mergulhado na proveta cheia de vinho (ou de mosto) até ao indicador. Ler a temperatura t °C do vinho (ou mosto), sendo:

p" as massas marcadas que restabelecem o equilíbrio r t °C, massa volúmica aparente:Expressar esta massa volúmica a 20 °C utilizando uma das tabelas II, III ou IV.

6. EXEMPLO DE CÁLCULO DA MASSA VOLÚMICA A 20 °C E DA DENSIDADE 20 °C/20 °C (MÉTODO DE REFERÊNCIA)

6.1. Picnometria em balança de dois pratos

6.1.1. Estabelecimento das constantes do picnómetro

1. Pesagem do picnómetro limpo e seco:Tara = picnómetro + p
p = 104,9454 g.

2. Pesagem do picnómetro cheio de água à temperatura t °C:Tara = picnómetro + água + p2
p2 = 1,2396 g para t = 20,5°C.

3. Cálculo da massa de ar existente no picnómetro:m = 0,0012 (p p2)
m = 0,0012 (104,9454 1,2396)
m = 0,1244 g.

4. Características a considerar:Tara do picnómetro vazio, p + m:
p + m = 104,9454 + 0,1244,
p + m = 105,0698 g.Volume a 20 °C = (p + m p2) · Ft °CF20,50 °C = 1,001900
V20 °C = (105,0698 1,2396) · 1,001900
V20 °C = 104,0275 ml.Massa de água a 20 °C = V20 °C · 0,998203
M20 °C = 103,8405 g.6.1.2. Determinação da massa volúmica a 20 °C e da densidade 20 °C/20 °C de um vinho seco:

p" = 1,2622 a 17,80 °Cr17,80 °C = 0,99788 g/ml

A tabela II permite calcular r20 °C a partir de rt °C por meio da relação:

Para t : 17,80 °C e para um título alcoométrico de 11 % vol., encontra-se c = 0,546.2. Picnometria em balança de prato único

6.2.1. Estabelecimento das constantes do picnómetro

1. Pesagem do picnómetro limpo e seco P = 67,7913 g.

2. Pesagem do picnómetro cheio de água à temperatura de t °C:P1 = 169,2715 a 21,65 °C.

3. Cálculo da massa de ar contida no picnómetro:m = 0,0012 (P1 P)
m = 0,0012· 101,4802
m = 0,1218 g.

4. Características a considerar:Tara do picnómetro vazio, P m:
P m = 67,7913 0,1218
P m = 67,6695 g
Volume a 20 °C = [P1 (P m)] Ft °C
F21,65 °C = 1,002140
V20 °C = (169,2715 67,6695) · 1,002140V20 °C = 101,8194 ml
Massa de água a 20 °C = V20 °C · 0,998203
M20 °C = 101,6364 g
Massa do frasco tara: To
To = 171,9160 g.6.2.2. Determinação da massa volúmica a 20 °C e da densidade 20 °C/20 °C de um vinho seco:

T1 = 171,9178 g
dT = 171,9178 171,9160 = 0,0018 g
P m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g
P2 = 169,2799 a 18 °Cr18 °C = 0,99793 g/ml

A tabela II permite calcular r 20 °C a partir de r t °C por meio da relação:

Para t = 18 °C e um título alcoometrico de 11 % vol., obtém-se c = 0,49

TABELA I

Tabela de factores Fpelos quais é necessário multiplicar a massa de água contida no picnómetro em vidro pyrex a t°, para calcular o volume do picnómetro a 20 °C.

TABELA II

Correcções c de temperatura sobre a massa volúmica de vinhos secos e de vinhos secos desalcoolizadosmedida num picnómetro em vidro pyrex a t°, para a referir a 20 °C

TABELA III

Correcções c da temperatura a introduzir na massa volúmica de mostos naturais e dos mostos concentradosmedida a t° por meio de um picnómetro em vidro pyrex para referir o resultado a 20 °C

TABELA IV

Correcções c da temperatura sobre a massa volúmica de vinhos de 13 % vol. e mais, contendo açúcar, medida por meio de um picnómetro em vidro pyrex a t°, para a referir a 20 °C

TABELA V

Correcções c de temperatura a introduzir na massa volúmica de vinhos secos e de vinhos secos desalcoolizadosmedida por meio de um picnómetro ou de um areómetro em vidro vulgar a t°, para a referir a 20 °C

TABELA VI

Correcções c da temperatura a introduzir na massa volúmica de mostos naturais e de mostos concentradosmedida a t° por meio de um picnómetro ou de um areómetro em vidro vulgar para a referir a 20 °C

TABELA VII

Correcções c de temperatura sobre a massa volúmica de vinhos de 13 % vol. e mais,contendo açúcar residual, medida por meio de um areómetro ou de um picnómetro em vidro vulgar a t ° para referir a 20 °C

2. AVALIAÇÃO DO TEOR DE AÇÚCARES DOS MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS E MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS POR REFRACTOMETRIA

1. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O teor de açúcares em gramas por litro e em gramas por quilograma de mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados é obtido a partir do índice de refracção a 20 °C, expresso em índice absoluto ou em percentagem em massa de sacarose, utilizando a tabela correspondente.

2. APARELHAGEM

2.1. Refractómetro do tipo Abbé

O refractómetro utilizado deve dispor de uma escala que indique:
- quer as percentagens em massa de sacarose a 0,1 %,
- quer os índices de refracção com 4 decimais.

O refractómetro deve dispor de um termómetro cuja escala se estenda, pelo menos, de +15 °C a +25 °C, e de um dispositivo de circulação de água que permita fazer medições a uma temperatura de 20 °C ± 5 °C.

As instruções operatórias deste instrumento devem ser estritamente respeitadas, nomeadamente no que respeita à calibração e à fonte luminosa.

3. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

3.1. Mostos e mostos concentrados

Passar, eventualmente, os mostos através de uma gaze seca dobrada em quatro e, depois de eliminadas as primeiras gotas de filtrado, fazer a determinação no produto filtrado.

3.2. Mostos concentrados rectificados

Utilizar, consoante a sua concentração, quer o mosto concentrado rectificado quer a solução obtida levando 200 g de mosto concentrado rectificado, pesados exactamente, a 500 g, com água.

4. MODO OPERATÓRIO

Levar a amostra a uma temperatura próxima de 20 °C. Colocar uma pequena quantidade de toma de ensaio no prisma inferior do refractómetro tendo o cuidado de que, quando os prismas estiverem pressionados um contra o outro, a toma de ensaio cubra uniformemente a superfície do vidro; efectuar a medição em conformidade com as instruções operatórias do aparelho utilizado.

Ler a percentagem em massa de sacarose com uma aproximação de 0,1 % ou anotar o índice de refracção com 4 decimais.

Efectuar pelo menos duas determinações em cada amostra preparada.

Anotar a temperatura t °C.

5. CÁLCULOS

5.1. Correcção de temperatura

5.1.1. Aparelhos graduados em % em massa de sacarose: utilizar a tabela I para a correcção de temperatura.

5.1.2. Aparelhos graduados em índices de refracção: a partir do índice medido a t °C utilizar a tabela I, a fim de obter (coluna 1) o valor correspondente da percentagem em massa de sacarose a t °C. Este valor é corrigido no que respeita à temperatura e expresso a 20 °C, por meio da tabela I.

5.2. Teor de açúcares de mostos e de mostos concentrados

A partir da percentagem em massa de sacarose a 20 °C utilizar a tabela II, a fim de obter o teor de açúcares em gramas por litro e em gramas por quilograma. O teor de açúcares é expresso em açúcar invertido com um decimal.

5.3. Teor de açúcares de mosto concentrado rectificado

A partir da percentagem em massa de sacarose a 20 °C utilizar a tabela III, a fim de obter o teor de açúcares em gramas por litro e em gramas por quilograma. O teor de açúcares é expresso em açúcar invertido com um decimal.

Se a medição tiver sido efectuada com mosto concentrado rectificado diluído, multiplicar o resultado pelo factor de diluição.

5.4. Índice de refracção de mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados

A partir da percentagem em massa de sacarose a 20 °C utilizar a tabela II, a fim de obter o índice de refracção a 20 °C. Este índice é expresso com 4 decimais.

TABELA I

Correcção a i

ntroduzir no caso de a percentagem em massa de sacarose ter sido determinada a uma temperatura diferente de 20 °C

TABELA II

Tabela que indica o teor de açúcares (4) de mostos e mostos concentrados em gramas por litro e em gramas por quilograma, determinado por meio de um refractómetro graduado quer em percentragem em massa de sacarose a 20 °C quer em índice de refracção a 20 °C. É igualmente indicada a massa volúmica a 20 °C

TABELA III

Tabela que indica o teor de açúcares (5) de mostos concentrados rectificados em gramas por litro e em gramas por quilograma, determinado por meio de um refractómetro graduado quer em percentagem em massa de sacarose a 20 °C quer em índice de refracção a 20 °C. É igualmente indicada a massa volúmica a 20 °C.

3. TÍTULO ALCOOMÉTRICO VOLÚMICO

1. DEFINIÇÃO

O título alcoométrico volúmico é igual ao número de litros de etanol contidos em 100 litros de vinho, sendo ambos os volumes medidos à temperatura de 20 °C. O seu símbolo é «% vol.».

Nota: Os homólogos do etanol, bem como etanol e os homólogos do etanol, compreendidos nos ésteres etílicos, estão incluídos no título alcoométrico, dado que se encontram no destilado.

2. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS

2.1. Destilação do vinho alcalinizado por uma suspensão de hidróxido de cálcio. Determinação do título alcoométrico do destilado.

2.2. Método de referência: determinação da massa volúmica do destilado por picnometria.

2.3. Métodos usuais

2.3.1. Determinação do título alcoométrico do destilado por areometria

2.3.2. Determinação do título alcoométrico do destilado por densometria por balança hidrostática.

2.3.3. Determinação do título alcoométrico do destilado por refractometria.

Nota: Para exprimir o título alcoométrico a partir da massa volúmica do destilado, utilizar as tabelas práticas I, II, II, dadas no anexo II do presente capítulo. Estas foram calculadas a partir da tabela alcoométrica internacional publicada em 1972 pela organização internacional de metrologia legal na sua recomendação no 22 e adoptada pela OIV (Assembleia geral de 1974). Na tabela I é dada a equação geral que relaciona o título alcoométrico volumétrico e a massa volúmica das misturas hidroalcoólicas em função da temperatura.

3. OBTENÇÃO DO DESTILADO

3.1. Aparelhagem

3.1.1. Aparelho de destilação que inclui:
- um balão de um litro de capacidade, de esmerilagem normalizada,
- uma coluna rectificadora de, aproximadamente, 20 cm de altura ou qualquer dispositivo destinado a evitar o arrastamento,
- uma fonte de calor: qualquer pirogenização das matérias extractivas deve ser evitada com dispositivo apropriado,
- um refrigerante terminado por um tubo delgado que conduza o destilado ao fundo do balão graduado receptor, contendo alguns mililitros de água.

3.1.2. Aparelho de arrastamento pelo vapor de água, que inclui:
1. Um gerador de vapor de água.
2. Um borbulhador,
3. Uma coluna rectificadora.
4. Um refrigerante.

Pode ser utilizado qualquer modelo de aparelho de destilação ou qualquer aparelho de arrastamento pelo vapor de água, desde que satisfaça o seguinte ensaio:

Destilar cinco vezes sucessivas uma mistura hidroalcoólica com um título alcoométrico de 10 % vol. O destilado deve apresentar um título alcoométrico de, pelo menos, 9,9 vol. depois da quinta destilação, ou seja, não deve ocorrer uma perda de álcool superior a 0,02 vol. no decurso de uma destilação.

3.2. Reagentes

3.2.1. Suspensão de hidróxido de cálcio 2 M

Obtida deitando, com cuidado, 1 litro de água quente (60 70 °C) sobre 120 g de cal viva CaO.

3.3. Preparação da amostra

Aos vinhos novos e espumantes é previamente retirada a maior quantidade possível do seu dióxido de carbono, através de agitação de 250 300 ml de vinho num frasco de 500 ml.

3.4. Modo operatório

Tomar, por meio de balão graduado, um volume de 200 ml de vinho. Anotar a temperatura do vinho.

Deitá-lo no balão do aparelho de destilação ou no borbulhador do aparelho de arrastamento por vapor de água. Lavar quatro vezes o balão graduado com 5 ml de água que se adiciona ao balão ou ao borbulhador. Juntar 10 ml de hidróxido de cálcio 2 M e alguns fragmentos de uma matéria porosa inerte (pedra-pomes) no caso da destilação.

Recolher o destilado no balão graduado de 200 ml utilizado na medição do vinho.

Recolher um volume igual a, aproximadamente, três quartos de volume inicial no caso de destilação e recolher 198 199 ml de destilado no caso do arrastamento por vapor de água. Completar até 200 ml com água destilada, após o destilado estar a uma temperatura idêntica à inicial, com uma aproximação de ± 2 °C.

Homogeneizar com cuidado, por meio de um movimento circular.

Nota: No caso de vinhos especialmente ricos em iões amoniacais, redestilar, eventualmente, o destilado nas condições acima descritas, substituindo a suspensão de hidróxido de cálcio por 1 ml de ácido sulfúrico a 10 % (v/v).

4. MÉTODOS DE REFERÊNCIA

Determinação do título alcoométrico do destilado por picnometria.

4.1. Aparelhagem

4.1.1. Utilizar o picnómetro calibrado como indicado no capítulo «Massa volúmica».

4.2. Modo operatório

Proceder à determinação da massa volúmica aparente do destilado a t °C, (3.4.) como indicado no capítulo 1 «Massa volúmica» em 4.3.1 e 4.3.2, ou seja rt esta massa volúmica.

4.3. Expressão dos resultados

4.3.1. Modo de cálculo

Exprimir o título alcoométrico a 20 °C por meio da tabela I. Na tabela, procurar na linha horizontal correspondente à temperatura T (expresso em número inteiro), imediatamente inferior a t °C, a menor massa volúmica superior a rt. Utilizar a diferença tabular lida por baixo desta massa volúmica para calcular a massa volúmica rt a esta temperatura T.

Na linha desta temperatura T procurar a massa volúmica r2 imediatamente superior a r e calcular a diferença entre estas duas massas volúmicasr e r2. Esta diferença é dividida pela diferença tabular lida à direita da massa volúmica r2. O quociente dá a parte decimal do título alcoométrico, enquanto a parte inteira deste título é indicada no cimo da coluna em que se encontra a massa volúmica r2.

É dado um exemplo de cálculo do título alcoométrico no anexo I do presente capítulo.

Nota: Esta correcção da temperatura foi introduzida num programa e pode, eventualmente, ser efectuada automaticamente.

4.3.2. Repetibilidade (r):

r = 0,10 % vol.4.3.3. Reprodutibilidade (R):

R = 0,19 % vol.

5. MÉTODOS USUAIS

5.1. Areometria

5.1.1. Aparelhagem

5.1.1.1. Alcoómetro

O alcoómetro deve responder às especificações para aparelhos da classe I ou da classe II definidas na recomendação internacional no 44 «Alcoómetros e areómetros para álcool» da OIML (Organização Internacional de Metrologia Legal).

5.1.1.2. Termómetro graduado em graus e 1/10 de grau de 0 °C a 40 °C, verificado com uma aproximação de 1/20.

5.1.1.3. Proveta cilíndrica de 36 m de diâmetro e 320 mm de altura, mantida na vertical por meio de um suporte de parafusos niveladores.

5.1.2. Modo operatório

Deitar o destilado (3.4.) na proveta cilíndrica. Mantê-la bem vertical. Introduzir o termómetro e o alcoómetro. A leitura do termómetro é feita um minuto depois de se ter agitado para obter a estabilização e homogeneidade de temperatura da proveta, do termómetro, do alcoómetro e do destilado. Retirar o termómetro e ler o título alcoométrico aparente depois de um minuto de repouso. Fazer pelo menos três leituras por meio de uma lupa. O título aparente medido a t °C será corrigido na acção da temperatura por meio da tabela II.

É necessário que a temperatura do líquido seja pouco diferente da temperatura ambiente (5 °C de diferença no máximo).

5.2. Densimetria por balança hidrostática

5.2.1. Aparelhagem

5.2.1.1. Utilizar a balança hidrostática como é indicado no capítulo «Massa volúmica».

5.2.2. Modo operatório

Proceder à determinação da massa volúmica aparente a t °C do destilado como é indicado no capítulo «Massa volúmica» em 5.2.2.

5.2.3. Expressão dos resultados

Exprimir o título alcoométrico a 20 °C, segundo as indicações de 4.3.1. por meio da tabela I, caso o flutuador seja de vidropyrex ou da tabela III, caso o flutuador seja de vidro vulgar.

5.3. Refractometria

5.3.1. Aparelhagem

5.3.1.1. Refractómetro que permita a medição dos índices de refracção compreendidos entre 1,330 e 1,346.

Consoante o tipo de aparelho, as medições são feitas:- quer a 20 °C, por meio de um dispositivo adequado,- quer à temperatura ambiente t °C, medida por meio de um termómetro que a permita determinar com uma aproximação de, pelo menos, 0,05 °C. É fornecida com o aparelho uma tabela de correcção da temperatura.

5.3.2. Modo operatório

A medição do índice de refracção é efectuada no destilado de vinho (3.4.), segundo o modo operatório prescrito para o tipo de aparelho utilizado.

5.3.3. Expressão dos resultados

O índice de refracção a 20 °C é introduzido na tabela IV de modo a obter o título alcoométrico.

Nota: A tabela IV dá a correspondência entre os índices de refracção das misturas hidroalcoólicas puras e dos destilados de vinho. No caso dos destilados de vinho, tem em conta as impurezas do destilado (alcoóis superiores principalmente). A presença de metanol é traduzida por uma diminuição do índice de refracção e, por conseguinte, do título alcoométrico.

6. EXEMPLO DE CÁLCULO DO TÍTULO ALCOOMÉTRICO DE UM VINHO

6.1. Picnometria em balança de dois pratos

6.1.1. As constantes do picnómetro foram determinadas e calculadas de acordo com o indicado no capítulo 1 «Massa volúmica e densidade relativa» no ponto 6.1.1.

6.1.2. Pesagem do picnómetro cheio de destiladoExemplo numéricot° C = 18,90° C
Tara = picnómetro + destilado a t° C + p" t° C corrigida = 18,70° C
p" = 2,8074 g

p + m p" = massa do destilado a t° C 105,0698 2,8074 = 102,2624 g

Massa volúmica aparente a t° C

6.1.3. Cálculo do título alcoométrico

Consulte-se a tabela de massas volúmicas aparentes de misturas hidroalcoólicas a diferentes temperaturas, como indicado anteriormente.
Na linha 18° da tabela de massas volúmicas aparentes, a mais pequena massa superior à massa observada 0,983076 é 0,98398, na coluna 11 %
A massa volúmica a 18° é:
(98307,6 + 0,7 × 22) 10 5 = 0,98323
0,98398 0,98323 = 0,00075
A parte decimal do título alcoométrico é 75/114 = 0,65
O título alcoométrico é:
11,65 % vol.

6.2. Picnometria em balança de prato único

6.2.1. As constantes do picnómetro foram determinadas e calculadas no capítulo 1 «Massa volúmica e densidade relativa» em 6.2.1.

6.2.2. Pesagem do picnómetro cheio de destilado

Peso do frasco-tara no momento da determinação (em gramas): T1 = 171,9178Picnómetro cheio de destilado a 20,50° C (em gramas): P2 = 167,8438Variação da pressão do ar: dT = 171,9178 171,9160= + 0,0018Massa do destilado a 20,50° C: Lt = 167,8438 (67,6695 + 0,0018)= 100,1725Massa volúmica aparente do destilado:

6.2.3. Cálculo do título alcoométrico

Consulte-se a tabela de massas volúmicas aparentes de misturas hidroalcoólicas a diferentes temperaturas, como indicado anteriormente.
Na linha 20° da tabela de massas volúmicas aparentes, a mais pequena massa superior à massa observada 0,983825 é 0,98471, na coluna 10 %
A massa volúmica a 20° é:
(98382,5 + 0,50 × 24) 10 5 = 0,983945
0,98471 0,983945 = 0,000765
A parte decimal do título alcoométrico é 76,5/119 = 0,64
O título alcoométrico é:
10,64 % vol.

FÓRMULA QUE PERMITE CALCULAR AS TABELAS ALCOOMÉTRICAS DAS MISTURAS DE ÁLCOOL ETÍLICO E DE ÁGUA

A massa volúmica «r», expressa em quilogramas por metro cúbico (kg/m³), de uma mistura de álcool etílico e de água à temperatura t, expressa em graus Celsius, é dada pela fórmula seguinte em função:

- do título mássico p expresso por um número decimal (6),- da temperatura t expressa em graus Celsius (EIPT 68),- dos coeficientes numéricos seguintes.A fórmula é válida para as temperaturas compreendidas entre 20 °C e +40 °C.

Coeficientes numéricos da fórmula

TABELA I

TÍTULO ALCOOMÉTRICO INTERNACIONAL A 20 °C

Tabela das massas volúmicas aparentes das misturas hidroalcoólicas- picnómetro em pyrexMassas volúmicas a t°, corrigidas da pressão do ar

TABELA II

TÍTULO ALCOOMÉTRICO INTERNACIONAL A 20 °C

Tabela de correcções a efectuar no grau alcoólico aparente para corrigir a acção da temperaturaAdicionar ou subtrair ao grau alcoólico aparente a t° (alcoómetro em vidro vulgar) a correcção abaixo indicada

TABELA III

TÍTULO ALCOOMÉTRICO INTERNACIONAL A 20 °C

Tabela das massas volúmicas aparentes das misturas hidroalcoólicas - aparelhos em vidro vulgarMassas volúmicas a t°, corrigidas da pressão do ar

TABELA IV

Tabela de correspondência entre os índices de refracção a 20 °C e os títulos alcoométricos a 20° C das misturas hidroalcoólicas puras e dos destilados

4. EXTRACTO SECO TOTAL

Matérias secas totais

1. DEFINIÇÃO

O extracto seco total ou matérias secas totais é o conjunto de todas as substâncias que em condições físicas determinadas não se volatilizam. Estas condições físicas devem ser fixadas de tal modo que as substâncias componentes desse extracto sofram o mínimo de alterações.

O extracto não redutor é o extracto seco total diminuído dos açúcares totais.

O extracto reduzido é o extracto seco total diminuído dos açúcares totais que excedem 1 g/l, do sulfato de potássio que exceda 1 g/l, do manitol se existir e de todas as substâncias químicas eventualmente adicionadas ao vinho.

O resto de extracto é o extracto não redutor diminuído da acidez fixa, expressa em ácido tartárico.

O extracto é expresso em gramas por litro e deve ser determinado com uma aproximação de 0,5 g.

2. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Método único: método densimétrico

O extracto seco total é calculado indirectamente a partir do valor da densidade do mosto e, no caso do vinho, a partir da densidade do vinho desalcoolizado.

Este extracto seco é expresso pela quantidade de sacarose que, dissolvida numa quantidade de água suficiente para perfazer 1 litro, dá uma solução da mesma densidade que o mosto ou que o vinho desalcoolizado. Esta quantidade é dada pela tabela I.

3. MODO OPERATÓRIO

A densidade relativa d2020 do vinho desalcoolizado (dr) é dada pela fórmula:dr = dv da + 1,000em que dv = densidade relativa do vinho a 20° C (corrigido da acidez volátil) (7),em que da = densidade relativa a 20° C da mistura hidroalcoólica com o mesmo título alcoométrico do vinho, pode, igualmente, calcular-se dr a partir das massas volúmicas a 20° C, rv do vinho e ra da mistura hidroalcoólica com o mesmo título alcoométrico pela fórmula:dr = 1,0018 (rv ra) + 1,000em que o coeficiente 1,0018 pode na prática ser equiparado a 1 quando r v for inferior a 1,05, o que é o caso mais frequente.

4. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Partindo da densidade d20r20 do vinho desalcoolizado ou da densidade d2020 do mosto, utilizar a tabela I a fim de obter o peso do extracto seco total em gramas por litros.

O peso do extracto seco total é expresso em gramas por litro com uma decimal.

TABELA I para o cálculo do teor de extracto seco total (g/l)

TABELA INTERCALAR

5. AÇÚCARES REDUTORES

1. DEFINIÇÃO

Os açúcares redutores são constituídos pelo conjunto dos açúcares de função cetónica ou aldeídica doseados pela sua acção redutora sobre a solução cupro-alcalina.

2. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS

2.1. Defecação

2.1.1. Método de referência: passagem do vinho neutralizado e desalcoolizado por uma coluna permutadora de aniões sob a forma de acetato onde os seus aniões são trocados por iões acéticos, seguida da defecação por acetato neutro de chumbo.

2.1.2. Métodos usuais: o vinho é tratado por um dos seguintes reagentes:

2.1.2.1. Acetato neutro de chumbo.

2.1.2.2. Hexacianoferrato (II) de zinco

2.2. Doseamento

2.2.1. Método único: depois de ter feito reagir o vinho ou o mosto defecado com uma quantidade determinada de solução cupro-alcalina, o excesso de iões cúpricos é doseado por iodometria.

3. DEFECAÇÃO

O líquido em que os açúcares são doseados deve apresentar um teor de açúcares compreendido entre 0,5 e 5 g/l.

Se o vinho for seco deve evitar-se a sua diluição durante a defecação; se for doce é necessário diluí-lo ao mesmo tempo que se procede à sua defecação, de modo a que o teor de açúcares varie entre os referidos limites, de acordo com o quadro seguinte:

DenominaçãoTeor de açúcares compreendido entre (g/l)Massa volúmica compreendida entreDiluição prevista (%)Mostos e jeropigas>125>1,0381vinhos doces, aguardentados ou não25 e 1251,005 e 1,0384vinhos adamados5 e 250,997 e 1,00520vinhos secos< 5< 0,997não se procede a diluição

4.3.1. Métodos de referência

4.3.1.1. Reagentes

3.1.1.1. Solução de ácido clorídrico (HCl), 1 M

3.1.1.2. Solução de hidróxido de sódio (NaOH), 1 M

3.1.1.3. Solução de ácido acético (CH3 COOH), 4 M

3.1.1.4. Solução de hidróxido de sódio (NaOH), 2 M

3.1.1.5. Resina permutadora de aniões [tipo Dowex 3 (20-50 mesh) ou resina equivalente]

Preparação da coluna de resina permutadora de aniões.

Colocar no fundo da bureta um pequeno tampão de la de vidro e 15 ml de resina permutadora de aniões (3.1.1.5).

Aquando da utilização da resina, submetê-la a dois ciclos completos de regeneração com passagens alternadas de solução de ácido clorídrico (3.1.1.1) e de hidróxido de sódio (3.1.1.2). Depois da lavagem com 50 ml de água destilada, transvasar a resina para um vaso cilíndrico, juntar 50 ml de solução 4 M de ácido acético (3.1.1.3) e agitar durante 5 minutos. Encher de novo a bureta e fazer passar através da coluna 100 ml de solução 4 M de ácido acético (3.1.1.3). (É preferível ter uma reserva de resina conservada num frasco cheio com esta solução 4 M de ácido acético). Lavar a coluna com água destilada até que o efluente seja neutro.

Regeneração da coluna de resina. Fazer passar 150 ml duma solução 2 M de hidróxido de sódio para eliminar os ácidos e uma grande parte da matéria corante fixada na resina. Lavar com 100 ml de água, fazer passar 100 ml de solução 4 M de ácido acético. Lavar a coluna até que o efluente seja neutro.

3.1.1.6. Solução de acetato neutro de chumbo (aproximadamente saturada):Acetato neutro de chumbo Pb (CH3 COO)2, 3 H2O 250 g
Água muito quente q.b. para 500 mlAgitar até dissolução.

3.1.1.7. Carbonato de cálcio, Ca CO33.1.2. Modo operatório

3.1.2.1. Vinhos secos

50 ml de vinho colocados num vaso cilíndrico de, aproximadamente, 10-12 cm de diâmetro, a que se adicionaram 1/2 (n 0,5) ml de uma solução M de hidróxido de sódio (3.1.1.2) (sendo n o volume de uma solução 0,1 M de hidróxido de sódio utilizado para a dosagem da acidez total em 10 ml de vinho), são evaporados num banho de água a ferver utilizando um jacto de ar quente até que o líquido esteja reduzido a, aproximadamente, 20 ml.

Fazer passar esse líquido através de uma coluna de resina permutadora de aniões sob a forma de acetato (3.1.1.5) à razão de 3 ml todos os 2 minutos. Recolher o efluente num balão graduado de 100 ml. Lavar 6 vezes o vaso e a coluna com 10 ml de água destilada e juntar, agitando, 2,5 ml de solução saturada de acetato de chumbo (3.1.1.6) e 0,5 g de carbonato de cálcio (3.1.1.7), agitar diversas vezes e deixar em repouso, durante, pelo menos, 15 minutos; perfazer com água até ao traço de graduação. Filtrar.

1 ml deste filtrado corresponde a 0,5 ml de vinho.

3.1.2.2. Mostos, jeropigas, vinhos doces e vinhos adamados

As diluições abaixo sugeridas são dadas a título indicativo

1. Mostos e jeropigas. Diluir a 10 % o líquido a analisar e recolher 10 ml desta diluição.

2. Vinhos doces, aguardentados ou não, cuja massa volúmica está compreendida entre 1,005 e 1,038. Recolher 20 ml de líquido a analisar, previamente diluído a 20 %.

3. Vinhos adamados, cuja massa volúmica está compreendida entre 0,997 e 1,005. Recolher 20 ml de vinho não diluído.Fazer passar o volume de vinho ou de mosto anteriormente indicado através de uma coluna permutadora de aniões sob a forma de acetato, à razão de 3 ml todos os 2 minutos. Recolher o efluente num balão graduado de 100 ml, lavar a coluna com água até à obtenção de, aproximadamente, 90 ml de efluente. Juntar 0,5 g de carbonato de cálcio e 1 ml de acetato de chumbo em solução saturada; agitar e deixar em repouso durante pelo menos 15 minutos agitando de tempos a tempos: perfazer com água até ao traço de graduação. Filtrar.

No caso:1. 1 ml de filtrado corresponde a 0,01 ml de mosto ou de jeropiga.2. 1 ml de filtrado corresponde a 0,04 ml de vinho doce.3. 1 ml de filtrado corresponde a 0,20 ml de vinho adamado.

3.2. Métodos usuais

3.2.1. Defecação com acetato neutro de chumbo

3.2.1.1. Reagentes

Solução de acetato neutro de chumbo (aproximadamente saturada) (ver 3.1.1.6).Carbonato de cálcio.

3.2.1.2. Modo operatório

3.2.1.2.1. Vinhos secos

Colocar 50 ml de vinho num balão graduado de 100 ml; juntar 1/2 (n-0,5) ml de solução M de hidróxido de sódio (3.1.1.2) sendo n o volume de solução 0,1 M utilizado para dosear a acidez total de 10 ml de vinho. Juntar, agitando, 2,5 ml de solução saturada de acetato de chumbo (3.1.1.6) e 0,5 g de carbonato de cálcio; (3.1.1.7) agitar diversas vezes e deixar em repouso durante, pelo menos, 15 minutos; perfazer com água até ao traço de graduação. Filtrar.1 ml de filtrado corresponde a 0,5 ml de vinho.

3.2.1.2.2. Mostos, jeropigas, vinhos doces e vinhos adamados

Num balão graduado de 100 ml, colocar um volume de vinho (ou de mosto ou de jeropigas) assim definido, sendo as diluições seguintes dadas a título indicativo:

1. Mostos e jeropigas. Diluir a 10 % o líquido a analisar, recolher 10 ml desta diluição.

2. Vinhos doces, aguardentados ou não, cuja massa volúmica esteja compreendida entre 1,005 e 1,038. Recolher 20 ml de líquido a analisar previamente diluído a 20 %.

3. Vinhos adamados, cuja massa volúmica seja compreendida entre 0,997 e 1,005. Recolher 20 ml de vinho não diluído.Juntar 0,5 g de carbonato de cálcio, aproximadamente 60 ml de água e 0,5 ou 1 ou 2 ml de acetato de chumbo em solução saturada, agitar e deixar em repouso durante, pelo menos, 15 minutos, agitando de tempos a tempos. Perfazer com água até ao traço da graduação. Filtrar.

No caso:1. 1 ml de filtrado corresponde a 0,01 ml de mosto ou de jeropiga.2. 1 ml de filtrado corresponde a 0,04 ml de vinho doce.3. 1 ml de filtrado corresponde a 0,20 ml de vinho adamado.

3.2.2. Defecação por haxecianoferrato (II) de zinco

Este processo de defecação deve apenas ser utilizado para os vinhos brancos, vinhos doces pouco corados e mostos.

3.2.2.1. Reagentes

3.2.2.1.1. Solução de hexacianoferrato (II) de potássio.

Hexacianoferrato (II) de potássio (K4 FE (CN)6·3H2O)150 g
Água q.b. para 1000 ml

3.2.2.1.2. Solução II de sulfato de zinco:Sulfato de zinco (Zn SO4 · 7 H2O) 300 g
Água q.b. para 1000 ml

3.2.2.2. Modo operatório

Num balão graduado de 100 ml, colocar um volume de vinho (ou de mosto ou de jeropiga) assim definido, sendo as diluições seguintes dadas a título indicativo:

1. Mostos e jeropigas: Diluir a 10 % o líquido a analisar, recolher 10 ml desta diluição.

2. Vinhos doces, aguardentados ou não, cuja massa volúmica esteja compreendida entre 1,005 e 1,0038. Recolher 20 ml de líquido a analisar, previamente diluído a 20 %.

3. Vinhos adamados,cuja massa volúmica esteja compreendida entre 0,997 e 1,005. Recolher 20 ml de vinho não diluído.

4. Vinhos secos, recolher 50 ml de vinho não diluído.Juntar 5 ml de solução de hixacionaferrato (II) de potássio (3.2.2.1.1) e 5 ml de solução II de sulfato de zinco (3.2.2.1.2). Homogeneizar. Perfazer com água até ao traço de graduação. Esperar 10 m. Filtrar.

No caso: 1. 1 ml de filtrado correspondente a 0,01 ml de mosto ou de jeropiga.2. 1 ml de filtrado correspondente a 0,04 ml de vinho doce.3. 1 ml de filtrado correspondente a 0,20 ml de vinho adamado.4. 1 ml de filtrado correspondente a 0,50 ml de vinho seco.

4. DOSEAMENTO

4.1. Reagentes

4.1.1. Solução cuproalcalinaSulfato de cobre puro (CuSO4· 5 H2O) 25 g
Ácido cítrico (C6 H8 O7 · H2O) 50 g
Carbonato de sódio cristalizado (Na2 CO3· 10 H2O) 388 g
Água q.b. para 1000 mlDissolver o sulfato de cobre em 100 ml de água, o ácido cítrico em 300 ml de água e o carbonato de sódio em 300 a 400 ml de água quente. Misturar a solução de ácido cítrico e a solução de carbonato de sódio. Em seguida, juntar a solução do sulfato de cobre e perfazer até ao litro.4.1.2. Solução de iodeto de potássio a 30 %:iodeto de potássio (Kl) 30 g
Água q.b. para 100 ml.Conservar em frasco de vidro de cor.4.1.3. Ácido sulfúrico a 25 %:Ácido sulfúrico (H2SO4)r20 = 1,84 g/ml 25 g
Água q.b. para 100 mlDeitar o ácido na água, deixar arrefecer e levar o volume a 100 ml.4.1.4. Goma de amido a 5 g/l:

Diluir 5 g de amido em aproximadamente 500 ml de água. Levar a ebulição agitando e manter a ebulição durante 10 minutos. Adicionar 200 g de cloreto de sódio (Na C1). Perfazer um litro depois do arrefecimento.- Tiossulfato de sódio, 0,1 M- Solução de açúcar invertido a 5 g/l:
Solução a utilizar para verificar a técnica de dosagem.

Num balão graduado de 200 ml, colocar:Sacarose pura (C12H22O11) 4,75 g
Água, aproximadamente 100 ml
Ácido clorídrico puro (HCl) r 20 = 1,16-1,19 g/ml) 5 mlMergulhar o balão em banho de água a 60° C durante o tempo suficiente para a temperatura da solução atingir 50° C, temperatura essa que se mantém durante 15 minutos. Em seguida, deixar o balão arrefecer espontaneamente durante 30 minutos; arrefecer depois por imersão num banho de água fria. Transvasar num balão graduado de 1 l, perfazer até ao litro. Esta solução conserva-se bem durante um mês. No momento da utilização, neutralizar a toma de ensaio (esta solução é, aproximadamente, 0,06M ácida), com uma solução de hidróxido de sódio.4.2. Modo operatório

Num balão cónico de 300 ml deitar 25 ml de solução cuproalcalina, 15 ml de água e 10 ml de solução proveniente da defecação. Este volume de solução açucarada não deve conter mais de 60 mg de açúcar invertido.

Juntar alguns grãos de pedra-pomes. Adaptar ao balão um refrigerante de refluxo e levar à ebulição, que deve ser alcançada em 2 minutos. Mantê-la durante, exactamente, 10 minutos.

Arrefecer imediatamente debaixo de uma corrente de água fria. Depois do arrefecimento completo, juntar 10 ml de solução de iodeto de potássio a 30 % (4.1.2), 25 ml de ácido sulfúrico a 25 % (4.1.3) e 2 ml de goma de amido (4.1.4).

Titular com a solução 0,1M de tiossulfato de sódio (4.1.5), ou seja, no número de mililitros utilizados.

Paralelamente, efectuar uma dosagem testemunha em que 10 ml de água destilada substituem os 10 ml de solução açucarada, sendo n2 o volume de tiossulfato utilizado.

4.3. Expressão dos resultados

4.3.1. Cálculos

A quantidade de açúcar, expressa em açúcar invertido, contida na toma de ensaio, é dada no quadro seguinte em função do número n2 - n de mililitros de tiossulfato utilizados.

Exprimir o teor do vinho em gramas de açúcar invertido por litro com um decimal, tendo em conta as diluições efectuadas no decurso da defecação e o volume da toma de ensaio.

4.3.2. Repetibilidade

r = 0,015 xixi = concentração de açúcar invertido em g/l da amostra.4.3.3. Reprodutibilidade

R = 0,058 xixi = concentração do açúcar invertido em g/l da amostra.

6. SACAROSE

1. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS

I. Método de pesquisa qualitativa por cromatografia em camada fina. A sacarose é separada dos outros açúcares por cromatografia em camada fina de celulose e revelada pelo reagente ureia-ácido clorídrico, em estufa a 105° C.

II. Método de pesquisa e dosagem por cromatografia líquida de elevada resolução. A sacarose é separada numa coluna de sílica ligada com alquilamina e detectada por refractometria. A quantificação é feita relativamente a um padrão externo analisado nas mesmas condições.

Nota:A autenticidade de um mosto ou de um vinho pode ser controlada pelo método que utiliza a RMN de deutério descrito para a detecção de enriquecimento dos mostos, mostos concentrados rectificados e de vinhos.Para a pesquisa e a dosagem da sacarose pode ser igualmente utilizada a cromatografia em fase gasosa descrita na alínea f) do capítulo 42.

2. MÉTODO DE PESQUISA QUALITATIVA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA

2.1. Material

2.1.1. Placas para cromatografia cobertas por uma camada fina de celulose.

2.1.2. Cuba para cromatografia

2.1.3. Seringa micrométrica ou micropipeta

2.1.4. Estufa regulável a 105 ± 2° C2.2. Reagentes

2.2.1. Carvão descorante

2.2.2. Fase móvel: cloreto de metileno-ácido acético (r 20 = 1,05 g/ml) - etanol - metanol - água (50 : 25 : 9 : 6 : 10).

2.2.3. ReveladorUreia 5 g
Ácido clorídrico 2 M 20 ml
Etanol 100 ml

2.2.4. Solução de referênciaGlicose 35 g
Frutose 35 g
Sacarose 0,5 g
Água q. b. para 1 000 ml2.3. Modo operatório

2.3.1. Preparação da amostra

Quando o mosto ou o vinho são muito corados, proceder à remoção da cor tratando-os com carvão activo.

No caso do mosto concentrado rectificado, utilizar a solução cujo teor de açúcares é de 25 % (m/m) (25° Brix), preparada como indicado na capítulo «Determinação do pH», no ponto 4.1.2, e diluí-la a um quarto, levando com água, 25 ml de amostra a um volume de 100 ml, utilizando um balão aferido.

2.3.2. Obtenção do cromatograma

A 2,5 cm do bordo inferior da placa depositar:
- 10µl da amostra,
- 10µl da solução de referência.

Colocar a placa na cuba para cromatografia saturada com os vapores da fase móvel e deixar migrar o líquido até 1 cm do bordo superior. Retirar a placa e secá-la sob uma corrente de ar quente. Repetir duas vezes a migração secando de cada vez a placa. Pulverizar uniformemente a placa com 15 ml do revelador e mantê-la na estufa a 105° C durante 5 minutos.

2.4. Resultados

A sacarose e a frutose aparecem sob a forma de manchas com cor azul escuro sobre fundo branco. A glicose dá uma mancha esverdeada menos intensa.

3. MÉTODO DE PESQUISA E DOSAGEM POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ELEVADA RESOLUÇÃO

As condições cromatográficas são apenas dadas a título indicativo.

3.1. Aparelhos

3.1.1. Cromatógrafo de fase líquida de elevada resolução equipado com:

1. Um injector com «loop» de 10 µl.

2. Um detector, refractómetro diferencial ou refractómetro interferómetro.

3. Uma coluna de sílica ligada a alkilamida (250 mm de comprimento e 4 mm de diâmetro interno).

4. Uma pré-coluna cheia com a mesma fase.

5. Um dispositivo de isolamento ou de termostatização a 30° C para o conjunto da pré-coluna/coluna.

6. Um registador, eventualmente um integrador.

7. Débito da fase móvel: 1 ml/min.

3.1.2. Dispositivo de filtração com membrana (0,45µm)

3.2. Reagentes

3.2.1. Água bidestilada

3.2.2. Acetonitrilo (CH3CN) de qualidade própria para HPLC

3.2.3. Fase móvel: acetonitrilo-água, previamente filtrados sobre membrana (0,45 µm), (80-20, v/v).Esta fase móvel deve ser desgaseificada antes da utilização.

3.2.4. Solução de referência: solução aquosa de sacarose a 1,2 g/l. Filtrá-la por membrana (0,45 µm).

3.3. Modo operatório

3.3.1. Preparação da amostra

- Caso dos vinhos e dos mostos.
Filtrar com membrana (0,45 µm).- Caso dos mostos concentrados rectificados. Utilizar a solução obtida diluindo o mosto concentrado rectificado a 40 % (m/v) como indicado na capítulo «Acidez total» em 5.1.2 e filtrá-la com membrana (0,45 µm).

3.3.2. Determinação cromatográfica

Injectar sucessivamente no cromatógrafo 10 µl da solução de referência e 10 µl da amostra preparada como indicado em 3.3.1. Repetir estas injecções na mesma ordem.Registar o cromatograma.O tempo de retenção da sacarose é próximo de 10 minutos.

3.4. Cálculos

Utilizar para o cálculo a média das duas respostas quer para a solução de referência quer para a amostra.

3.4.1. Caso dos vinhos e dos mostos

Calcular o teor em g/l.

3.4.2. Caso dos mostos concentrados rectificados

Seja C g/l o teor de sacarose da solução de mosto concentrado rectificado a 40 % (m/v).

Teor de sacarose em gramas por quilograma de mostos concentrado rectificados: 2,5 · C.

3.5. Expressão dos resultados

O teor de sacarose dos vinhos, mostos e mostos concentrados rectificados é expresso em gramas por litro (vinhos e mostos) e em gramas por quilograma (mostos concentrados rectificados) com um decimal.

7. GLICOSE E FRUTOSE

1. DEFINIÇÃO

A glicose e a frutose podem ser doseadas individualmente por método enzimático, com vista unicamente ao cálculo da relação glicose/frutose.

2. PRINCÍPIO

A glicose e a frutose são fosforiladas pelo adenosina-trifosfato (ATP) no decurso de uma reacção enzimática-catalizada pela hexoquinase (HK) e originam glicose-6-fosfato (G6P) e frutose-6-fosfato (F6P):

glicose + ATP G6P + ADP

frutose + ATP F6P + ADP

Numa primeira fase o glicose-6-fosfato é oxidado em gluconato-6-fosfato pelo nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (NADP), em presença da enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6 PDH). A quantidade de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reduzido (NADPH) surgido corresponde à quantidade de glicose-6-fosfato e, portanto, à de glicose.

G6P + NADP+ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+

É o nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reduzido que é doseado tendo por base a sua absorvência a 340 mm.

Quando esta reacção termina, o frutose-6-fosfato é transformado, sob a acção da fosfoglicose-isomerase (PGl), em glicose-6-fosfato.

O glicose-6-fosfato reage de novo com o nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato para originar gluconato-6-fosfato e nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reduzido; este será doseado.

3. APARELHAGEM

- Espectrofotómetro que permita efectuar a medição a 340 nm, máximo de absorção do NADPH. Dado que se trata de medições absolutas (sem calibração, mas com referência ao coeficiente de extinção do NADPH) as escalas dos comprimentos de onda e das absorvências do aparelho devem ser controladas.Na ausência, utilizar um espectrofotómetro de espectro descontínuo que permita efectuar medições a 334 nm ou a 365 nm,- Cubas de vidro de 1 cm de trajecto óptico ou cubas de utilização única,- Pipetas para teste enzimático de 0,02 - 0,05 - 0,1 - 0,2 ml.

4. REAGENTES

4.1. Solução 1: tampão (trietanolamina 0,3 M; pH = 7,6; 4 10 3 M em Mg 2+): 11,2 g de cloridrato de trietanolamina (C2H5)3N · HCL) e 0,2 g de Mg SO4 · 7 H2O são dissolvidos em 150 ml de água bidestilada; adicionar aproximadamente 4 ml da solução 5 M de hidróxido de sódio (NaOH) para obter um pH de 7,6 e levar o volume a 200 ml.

Esta solução tampão pode conservar-se 4 semanas a +4 °C.

4.2. Solução 2: solução de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (cerca de 11,5 10 3M: dissolvem-se 50 mg de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato-dissódico em 5 ml de água bidestilada.

A solução conserva-se a +4 °C durante 4 semanas.

4.3. Solução 3:solução de adenosina-52-trifosfato (aproximadamente 81 10 3M: são dissolvidos 250 mg de adenosina-52-trifosfato dissódico e 250 mg de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) em 5 ml de água bidestilada.

Esta solução conserva-se durante 4 semanas a +4 °C.

4.4. Solução 4: Hexoquinase/glicose-6-fosfato-desidrogenase : misturar 0,5 ml de hexoquinase (2 mg de proteína/ml ou seja 280 U/ml) e 0,5 ml de glicose-6-fosfato-desidrogenase (1 mg de proteína por ml).

A solução conserva-se durante um ano a +4 °C.

4.5. Solução 5:Fosfoglicose-isomerase (2 mg de proteína por ml, ou seja 700 U/ml). A suspensão é utilizada sem diluição.

A solução conserva-se um ano a +4 °C.

Nota: O conjunto dos reagentes necessários para este doseamento está comercializado.

5. MODO OPERATÓRIO

5.1. Preparação da amostra

Em função da quantidade estimada de glicose + frutose por litro, efectuar as seguintes diluições:

Medição a 340 e 334 nm365 nmDiluição com águaFactor F de diluiçãoAté 0,4 g/l 0,8 g/l--Até 4,0 g/l 8,0 g/l1+ 9 10Até 10,0 g/l20,0 g/l1+ 24 25Até 20,0 g/l40,0 g/l1+ 49 50Até 40,0 g/l80,0 g/l1+ 99 100acima de 40,0 g/l80,0 g/l1+9991 000

5.2. Dosagem

Com o espectrofotómetro regulado no comprimento de onda 340 nm, efectuar as medições em relação ao ar (sem cuba no trajecto óptico) ou em relação à àgua.Temperatura 20 a 25 °C.Em 2 cubas de 1 cm de trajecto óptico, introduzir:

Testemunha DosagemSolução 1 (4.1) (referida a 20 °C) 2,50 ml 2,50 ml
Solução 2 (4.2)0,10 ml 0,10 ml
Solução 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml
Amostra a dosear- 0,20 ml
Água bidestilada 0,20 ml -

Misturar e, depois de aproximadamente 3 minutos, ler a absorvência das soluções (A1). Desencadear a reacção adicionando:Solução 4(4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Misturar; esperar 15 minutos; efectuar a medição da absorvência e verificar a paragem da reacção após 2 minutos. (A2).

Adicionar imediatamente:Solução 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Misturar; efectuar a leitura ao fim de 10 minutos; verificar a paragem da reacção após 2 minutos. (A3).

Determinar as diferenças de absorvência:
- A2-A1 corresponde à glicose,
- A3-A2 corresponde à frutose.Para a testemunha e para a dosagem.

Deduzir a diferença de absorvência da testemunha (D AT) e a do doseamento (D AD) e estabelecer:para a glicose: D AG = D AD D ATpara a frutose: D AF = D AD D AT.

Nota: O tempo necessário para a acção dos enzimas pode variar de um lote para outro. Ele só é dado aqui a título indicativo. Recomenda-se que seja determinado, sempre, para cada lote.

5.3. Expressão dos resultados

5.3.1. Cálculo

A fórmula geral para o cálculo das concentrações é a seguinte:V = volume do teste (ml)
v = volume da amostra (ml)
PM = massa molecular da substância a dosear
d = trajecto óptico da cuba (cm)
e = coeficiente de absorção do NADPH a 340 nm = 6,3 (mmole 1. l. cm 1)
V = 2,92 ml para o doseamento da glicose
V = 2,94 ml para o doseamento da frutose
v = 0,20 ml
PM = 180
d = 1

Obtém-se:para a glicose: Cg/l = 0,417 ·D AG
para a frutose: Cg/l = 0,420· D AF

Se tiver sido efectuada uma diluição aquando da preparação da amostra, multiplicar o resultado pelo factor F.

Nota:Se as medidas forem feitas nos comprimentos de onda 334 ou 365 nm, obtém-se:- medida a 334 nm: e = 6,2 (mmole · l · cm 1)para a glicose : Cg/l = 0,425 · D AG
para a frutose: Cg/l = 0,428 · D AF- medida a 365 nm: e = 3,4 (mmole · l · cm 1)para a glicose : Cg/l = 0,773 · D AG
para a frutose: Cg/l = 0,778 · D AF5.3.2. Repetibilidade (r)

r = 0,056 xi5.3.3. Reprodutibilidade (R)

R = 0,12 + 0,076 xi
xi = teor em glicose ou frutose em g/l

8. DETECÇÃO DO ENRIQUECIMENTO DOS MOSTOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICADOS E DE VINHOS POR APLICAÇÃO DA RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DO DEUTÉRIO (RMN-FINS/SNIF-NMR)

1. DEFINIÇÃO

Os átomos de deutério existentes nos açúcares e na água de um mosto de uma uva vão ser redistribuídos após a fermentação nas moléculas I, II, III e IV do vinho:CH2D CH2 OH CH3 CHD OH
I IICH3 CH2 OD HOD
III IV

A adição de açúcares exógenos (chaptalização) antes da fermentação do mosto reflectir-se-á na redistribuição do deutério.

Por comparação com os valores dos parâmetros relativos a um vinho testemunha natural da mesma região, o enriquecimento com um açúcar exógeno traduzir-se-á pelas seguintes variações:

Parâmetros
Vinho(D/H)I(D/H)II(D/H)QW R- Natural - Enriquecido - açúcar de beterraba - açúcar de cana - açúcar de milho

(D/H)I : relação isotópica associada à molécula I(D/H)II : relação isotópica associada à molécula II(D/H)QW : relação isotópica da água do vinho.

R = 2(D/H)II/(D/H)I, exprime a distribuição relativa do deutério nas moléculas I e II; R é medido directamente a partir das intensidades h dos picos sendo R = 3hII/hI.

(D/H)I, caracteriza principalmente a espécie vegetal que sintetizou o açúcar e, em menor grau, a geografia do local de colheita (natureza da água utilizada no decurso da fotossíntese).

(D/H)II representa a climatologia do local de produção das uvas (natureza da água da chuva e condições meteorológicas) e, em menor grau, a concentração em açúcares do mosto inicial.

(D/H)QW representa a climatologia do local de produção e a riqueza em açúcares do mosto inicial.

2. PRINCÍPIO

A determinação dos parâmetros anteriormente definidos [determinação de R, (D/H)I (D/H)II], é efectuada por RNM do deutério no etanol extraído do vinho ou dos produtos da fermentação do mosto, do mosto concentrado ou do mosto concentrado rectificado obtidos em determinadas condições e é eventualmente completada pela determinação da relação isotópica da água extraída do vinho (D/H)QW e pela determinação da relação isotópica 13C/12C do etanol.

Enquanto se espera a constituição de um banco de dados comunitário;- no caso dos vinhos, as recolhas de controlo efectuadas nas zonas de produção devem ser acompanhadas por recolhas de amostras testemunhas naturais (pelo menos três) da mesma origem (local geográfico e colheitas); estas diversas colheitas são efectuadas em três exemplares.- no caso dos mostos, mostos concentrados, mostos concentrados rectificados, as amostras testemunhas (pelo menos três) são constituídas por mostos naturais da mesma origem (local geográfico e colheita).

Para o controlo dos produtos elaborados no seu próprio território, e até que se constitua um banco de dados comunitário, os Estados-membros podem utilizar um banco de dados nacional provisório.

3. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE

3.1. Extracção do etanol e da água do vinho

Nota: Pode ser utilizado qualquer dispositivo de extracção do etanol desde que permita recuperar de 98 a 98,5 % do etanol do vinho ou do produto fermentado num destilado cujo teor será de 92 a 93 % mas (95 % vol.).

3.1.1. Aparelhagem e reagentes

Dispositivo para a extracção do etanol (fig. 1) constituído por: - Placa de aquecimento eléctrico regulável,- Balão esmerilado de 1 l,- Coluna Cadiot de banda giratória (móvel em Teflon),- Balões cónicos esmerilados de 125 ml,- Frascos de rolha plástica de 125 e 60 ml.- Reagentes para a dosagem da água segundo a técnica de Karl Fischer (por exemplo Merck 9241 e 9243).

3.1.2. Modo operatório

3.1.2.1. Determinar o título alcoométrico do vinho, tv, com a uma aproximação igual ou superior a 0,05 % vol.

3.1.2.2. Extracção do etanol

Introduzir uma toma homogénea de 500 ml de vinho de título alcoométrico tv no balão do aparelho de destilação com uma taxa de refluxo constante de, aproximadamente, 0,9. Colocar um balão cónico esmerilado de 125 ml, previamente tarado, para receber o destilado. Recolher do líquido em ebulição, entre 78,0 e 78,2 °C, aproximadamente, 40 a 60 ml. Quando a temperatura exceder 78,5 °C parar a recolha durante 5 minutos.

Quando a temperatura voltar a 78 °C recolher de novo o destilado até 78,5 °C e repetir esta operação até que a temperatura, após paragem da recolha e funcionamento em circuito fechado, não volte a descer. A destilação completa dura cerca de 5 horas. Este procedimento permite recuperar entre 98 a 98,5 % do álcool total do vinho num destilado que apresenta um título alcoométrico entre 92 e 93 % mas (95 % vol.), título para o qual as condições RMN descritas no no 4 foram estabelecidas.

O etanol recuperado é pesado.

É conservada num frasco de 60 ml uma toma de ensaio homogénea de 60 ml das fracções finais de destilação que representa a água do vinho. A sua relação isotópica será eventualmente determinada.

Nota: Se se dispõe dum espectómetro equipado com uma sonda de 10 mm (cf. 4), é suficiente uma toma homogénea de 300 ml de vinho.

3.1.2.3. Determinação do título alcoométrico do álcool extraído

Pelo método de Karl Fischer, determina-se a massa de água, p2g, existente numa toma de ensaio de cerca de 0,5 ml de álcool de massa p, conhecida com exactidão.

Figura 1

Dispositivo para extracção do etanol

O teor mássico de etanol é dado por:

3.2. Fermentação dos mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados

3.2.1. Material e reagentes

- Ácido tartárico,
- Bacto Yeast Nitrogen (Base without amino acids) DIFCO,
- Leveduras secas activas (Saccharomyces cerevisiae).

Se se conhecer a relação isotópica da água do mosto, podem reactivar-se as leveduras, previamente à inoculação durante 15 minutos num mínimo de água morna (1 g em 50 ml) não destilada, que tenha uma relação isotópica vizinha à da água do mosto.

Quando não se conhecer a relação isotópica da água do mosto, é preferível inocular directamente.

A quantidade de leveduras secas a utilizar é da ordem de 1 g ou seja à volta de 1010 células para 1 l de mosto.

Recipiente para a fermentação, com uma capacidade de 1,5 l, munido de um dispositivo que permita operar ao abrigo do ar e condensar os vapores do álcool, pois não é tolerável a perda de etanol durante a fermentação. A taxa de conversão dos açúcares fermentescíveis em etanol deve ser superior a 98 %.

3.2.2. Modo operatório

3.2.2.1. Caso dos mostos

- Mostos frescosColocar 1 l de mosto cuja concentração em açúcares redutores fermentescíveis foi previamente determinada, no recipiente previsto para a fermentação. Adicionar 1 g de leveduras secas previamente reactivadas. Instalar um dispositivo que permita operar ao abrigo do ar. Conduzir a fermentação a uma temperatura próxima de 20 °C até ao esgotamento dos açúcares. Após determinação do título alcoométrico do produto da fermentação e cálculo da taxa de conversão dos açúcares em álcool, o líquido fermentado obtido é centrifugado e submetido à destilação para extrair o etanol.

- Mostos amuados com dióxido de enxofreDessulfitar um volume de mosto ligeiramente superior a 1 l (1,2 l) fazendo borbulhar uma corrente de azoto no mosto levado a banho-maria com refluxo, a 70-80 °C, até que o teor total em dióxido de enxofre seja inferior a 200 mg/l. Evitar provocar qualquer concentração de mosto por evaporação da água, utilizando para tal um refrigerante eficaz.Colocar 1 l de mosto dessulfitado num recipiente para fermentação e prosseguir tal como é indicado para os mostos frescos.Nota: Se se tiver utilizado metabissulfito de potássio para sulfitar o mosto, é necessário, antes de dissulfitar, adicionar ao mosto ácido sulfúrico à razão de 0,25 ml de ácido sulfúrico concentrado (r20 = 1,84 g/ml) por grama de metabissulfito utilizado em cada litro de mosto.

3.2.2.2. Caso dos mostos concentrados

No recipiente para fermentação, colocar um volume V ml de mosto concentrado contendo uma quantidade conhecida da açúcar, próxima de 170 g. Perfazer o volume de 1 l com (1 000-V) ml de água com a mesma relação isotópica que a água do mosto natural testemunha. Inocular como está indicado em 3.2.1, adicionar 3 g de Bacto Yeast Nitrogen (Base Without amino acids) DIFCO. Homogeneizar e prosseguir como anteriormente.

3.2.2.3. Caso dos mostos concentrados rectificados

Proceder segundo a técnica descrita no ponto 3.2.2.2, perfazendo o volume de 1 l com (1 000-V) ml de água com a mesma relação isotópica que a água do mosto natural testemunha, no qual serão dissolvidos 3 g de ácido tartárico.

Nota: Reservar um volume de 50 ml de amostra de mosto, de mosto dissulfitado ou do mosto concentrado, ou de mosto concentrado rectificado com vista à eventual extracção de água e à determinação da sua relação isotópica (D/H)QW.A extracção da água dos mostos poderá ser feita muito simplesmente através da destilação azeotrópica com tolueno.

3.3. Preparação da amostra de álcool para a medida RMN

3.3.1. Reagentes

N,N-tetrametilureia (TMU); utilizar uma amostra de TMU de referência de relação isotópica D/H dada e controlada. Esta amostra pode ser fornecida por:- Direcção-Geral da Ciência, Investigação e Desenvolvimento,
Gabinete Comunitário de Referência,
Rue de la Loi 200,
B-1049 Bruxelas.

3.3.2. Modo operatório

- Sonda RMN de 15 mm de diâmetro:Num frasco previamente tarado, introduzir 7 ml do álcool obtido como em 3.1.2 e pesá-lo com uma aproximação de 0,1 mg, ou seja mA; colher, em seguida, 3 ml do padrão interno (TMU) e pesar com uma aproximação de 0, 1 mg, ou seja mst · Homogeneizar a mistura por agitação,

- Sonda RMN de 10 mm de diâmetro:São suficientes 3,2 ml de álcool e 1,3 ml de TMU.
Conforme o tipo de espectómetro e de sonda utilizados (Cf. no 4), adicionar uma quantidade suficiente de hexafluorobenzeno como substância da estabilização campo-frequência (lock).

EspectómetroSonda10 mm15 mm7,05 T150 µl200 µl9,4 T 35 µl 50 µl

3.4. Preparação da amostra de água para a medida de RMN, com vista à eventual determinação da sua relação isotópica

3.4.1. Reagentes

N,N-tetrametilureia (TMU) : ver ponto 3.3.1.

3.4.2. Modo operatório

Num frasco tarado, introduzir 3 ml de água obtida como em 3.1.2 ou 3.2 (nota). Pesá-los a 0,1 mg aproximadamente, ou seja m2E; introduzir em seguida 4 ml do padrão interno (TMU) e pesá-los a 0,1 mg aproximadamente, ou seja m2st. Homogeneizar por agitação.

Nota: Se o laboratório dispuser de um espectómetro de massa de relações isotópicas, esta medida poderá ser determinada com este aparelho, de modo a aligeirar a carga do espectómetro RMN, dado que é necessário calibrar a relação TIV (5.2) para cada série de vinhos estudados.

4. REGISTO DO ESPECTRO RMN ²H DO ÁLCOOL E DA ÁGUA

Determinação dos parâmetros isotópicos.

4.1. Material

- Espectómetro RMN munido de um sonda específica «deutério» regulado na frequência o característica, do campo Bo (por exemplo, para Bo = 7,05 T, Vo = 46,05 MHz e para Bo = 9,4 T, Vo = 61,4 MHz), possuidor de um canal de separação do protão B2 e de um canal de estabilização campo-frequência (lock) na frequência do flúor. A resolução, medida sobre o espectro, transformada sem multiplicação exponencial (isto é, LB = 0) (fig. 2b) e expressa pela largura medida a meia altura dos picos de metilo e metileno do etanol e do pico metilo do TMU, deve ser inferior a 0,5 Hz.

A sensibilidade medida com um factor de multiplicação exponencial LB igual a 2 (fig. 2a) deve ser igual ou superior a 150 para o pico metilo do etanol com teor alcoólico 95 % vol (93,5 % mas). Nestas condições, o intervalo de confiança da medida da altura do pico calculado com uma probabilidade de 97,5 % (teste a 1 aile) e 10 repetições do espectro, é de 0,35 %.- Dispositivo de troca automática de amostras (eventualmente),- Equipamento para o tratamento de dados,- Tubos de amostras de 15 mm ou 10 mm, consoante a «performance» do espectómetro.

4.2. Regulação do espectómetro e verificações

4.2.1. Regulação

Proceder às regulações habituais da homogeneidade e da sensibilidade, segundo as indicações do fabricante.

4.2.2. Verificação da validade das regulações

Utilizar etanóis de referência designados pelas letras C (etanol da cana do açúcar), V (etanol do vinho), B (etanol da beterraba), que apresentem um teor isotópico diferente, mas precisamente calibrado. O seu significado é o seguinte: C - álcool de cana de açúcar ou de milho; V - álcool de vinho e B- álcool de beterraba. Estas amostras são fornecidas pelo «Bureau communautaire de référence».

Seguindo o modo operatório descrito em 4.3 determinar os valores isotópicos dos álcoois já designados, anotando Cmes, Vmes, Bmes (ver 5.3)

Compará-los com os valores de referência correspondentes, designados anotando Cst, Bst, Vst (ver 5.3).

Figura 2a

Espectro RMN²H de um etanol de vinho com um padrão interno (TMU : N,N-tetrametilureia)

Figura 2b

Espectro²H do etanol realizado nas mesmas condições que as da figura 2a, mas sem multiplicação exponencial (LB = 0)

O desvio-padrão da repetibilidade obtido com a média de 10 repetições de cada espectro deve ser inferior a 0,01 para a relação R e inferior a 0,3 ppm para (D/H)I e (D/H)II.

Os valores médios obtidos para os diferentes parâmetros isotópicos [R, (D/H)I (D/H)II] devem situar-se no desvio-padrão da repetibilidade correspondente, dado, para estes parâmetros, para os três álcoois de referência, pelo «Bureau communautaire de référence». Caso contrário, refazer as regulações.

4.3. Condições de obtenção dos espectros RMN

Colocar a amostra de álcool preparada como em 3.3 (ou a amostra de água preparada em 3.4) num tubo de 10 ou 15 mm e introduzir na sonda.

As condições de aquisição de espectros RMN são as seguintes:
- a temperatura da sonda deve ser constante (por exemplo 302 K),
- tempo de aquisição de 6,8 s, pelo menos, para 1200 Hz de largura do espectro. (Memória 16K) a 61,4 Mz, isto é, aproximadamente 20 ppm a 61,4 MHz ou 27 ppm a 46,1 MHz,
- impulsão: 90°,
- regular o prazo da aquisição; o seu valor deve ser da mesma ordem de grandeza que o tempo de amostragem (dwell time),
- detecção em quadratura: fixar o «offset» 01 entre os sinais de referência -OD e -CHD para o etanol e entre os sinais de referência HOD e TMU para a água,
- determinar o valor do «offset» de separação 02 a partir do espectro protónico medido pela bobina de separação no mesmo tubo. É obtida uma boa separação quando O2 se situar no meio do intervalo de frequência existente entre os grupos CH3- e -CH2-. Utilizar o método de separação por banda larga.

Efectuar um número NS suficiente de acumulações para cada espectro a fim de obter a relação sinal/ruído dado em no 4-1 e repetir NE = 10 vezes esta série de NS acumulações. Os valores de NS dependem do tipo de espectómetro e da sonda utilizados (cf. no 4) e escolher-se-á, por exemplo:
Espectómetro
Sonda
10 mm
15 mm
7,05 T
NS = 304
NS = 200
9,04 T
NS = 200
NS = 128

5. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

5.1. Caso do etanol

Para cada um dos 10 espectros determinar (ver espectro RMN do etanol, fig. 2a):Determinar:- CH3 CHDOH mst e mA ver 3.3.2- tDm ver 3.1.2.3.- (D/H)st = relação isotópica do padrão interno

(TMU) indicado no frasco fornecido pelo «Bureau communautaire de référence» (BCR).

A utilização das alturas dos sinais, dado que tem mais precisão do que as áreas mensuráveis, pressupõe larguras de pico a meia-altura iguais, o que é uma aproximação razoável (figura 2b).

5.2. Caso da água

Quando a relação isotópica da água é determinada por RMN, a partir da mistura água - - TMU, utiliza-se a seguinte relação:sendo- m2st e m2E ver 3.4.2,- (D/H)st = relação isotópica do padrão interno (TMU) indicado no frasco fornecido pelo «Bureau communautaire de référence» (BCR).

5.3. Para cada um dos parâmetros isotópicos, calcular a média de 10 determinações e o intervalo de confiança.

É possível efectuar estes cálculos em série utilizando um equipamento de tratamento de dados adaptável ao calculador do espectómetro (Exemplo: RMN-FINS).

Nota: Se após a regulação do espectómetro, existir um desvio sistemático entre os valores médios obtidos para as características isotópicas dos álcoois de referência (4.2.2) e os valores indicados pelo«Bureau communautaire de référence», com uma aproximação ao desvio-padrão, pode aplicar-se a correcção seguinte para encontrar o valor verdadeiro duma amostra X, qualquer.

A interpolação efectuar-se-á tomando os valores das amostras de referência que enquadram as da amostra X.

Sendo (D/H)iXmes o valor medido e (D/H)iXcorr o valor corrigido, ter-se-á:(D/H)iXcorr = (D/H)iBst + a [(D/H)iXmes (D/H)iBmes]

Exemplo:Amostras de referência fornecidas e padronizadas pelo Gabinete Comunitário de Referências:(D/H)IVst = 102,0 ppm (D/H)IBst = 91,95 ppm.Amostras de referência analisadas pelo laboratório:(D/H)IVmes = 102,8 ppm (D/H)IBmes = 93,0 ppm.Amostra suspeita, não corrigida(D/H)IXmes = 100,2 ppm.Calcula-se a = 1,0255 e (D/H)IXcorr = 99,3 ppm.

6. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Comparar o valor RX obtido para a relação R da amostra suspeita com as relações obtidas para os vinhos testemunha. Se RX se afastar mais de 2 desvios-padrão do valor médio RT obtido para os vinhos testemunha, deve presumir-se que houve adulteração.6.1. Enriquecimento com açúcar de beterraba, açúcar de cana ou glicose de milho

6.1.1. Caso dos vinhos

R X superior a RT: suspeita de adição de açúcar de beterraba.
RX inferior a RT: suspeita de adição de açúcar de cana ou de açúcar de milho.Notar que (D/H)IIX et (D/H)WQX se apresentam aumentados.Examinar (D/H)IX. Existe suspeita de:- enriquecimento com açúcar de beterraba:(D/H)IX da amostra suspeita é inferior a (D/H)IT, valor médio obtido para as amostras testemunhas, em mais de um desvio-padrão da medição,- enriquecimento com açúcar de cana ou açúcar de milho:
(D/H)IX é superior a (D/H)IT, em mais de um desvio-padrão.Cálculo de enriquecimento, E, expresso em % vol. de etanol:- Caso de um enriquecimento com açúcar de beterraba:(D/H)IB = relação isotópica para a situação I do álcool de beterraba:(D/H)IB = 92,5 (8) tV = título alcoométrico do vinho analisado (X).- Caso de um enriquecimento com açúcar de cana ou de milho:
(D/H)IC = relação isotópica para a situação do álcool de cana de açúcar ou de milho: (D/H)IC = 110,5 (9),tV = título alcoométrico do vinho analisado (X).6.1.2. Caso dos mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados

Os valores dos parâmetros isotópicos do álcool extraído, como indicado em 3.1, do produto fermentado obtido (3.2) a partir do mosto, mosto concentrado e mosto concentrado rectificado são examinados, de acordo com as prescrições do ponto 6. «Interpretação dos resultados», ponto 6.1.1, comparativamente ao álcool extraído do produto de fermentação dos mostos naturais testemunha.

O enriquecimento, E % vol, exprime o volume de álcool adicionado ao produto fermentado. Conhecendo a diluição eventualmente efectuada antes da fermentação (mostos concentrados e mostos concentrados rectificados) e admitindo que 16,83 g de açúcar dão origem a 1 % vol de álcool, calcular a quantidade, em massa, de açúcar adicionado por litro de mosto, mosto concentrado ou mosto concentrado rectificado.6.2. Enriquecimento com uma mistura de açúcar de beterraba e de açúcar de cana ou de glicose de milho

As relações isotópicas (D/H)I e R são menos alteradas do que no caso do enriquecimento com um único tipo de açúcar.

(D/H)II é aumentado, bem como (D/H)QW.A confirmação destas adições pode ser feita através da determinação da relação13C/12C do etanol por espectrometria de massa; neste caso, essa relação é aumentada.


9. CINZAS 1. DEFINIÇÃO

Chama-se cinzas ao conjunto dos produtos da incineração do resíduo da evaporação do vinho, conduzida de modo a obter a totalidade dos catiões (excluindo o amónio) sob a forma de carbonatos e outros sais minerais anidros.2. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Incineração do extracto do vinho conduzida entre 500 °C e 550 °C até à combustão completa do carbono.3. APARELHAGEM E UTENSÍLIOS

3.1. Banho de água a 100 °C.

3.2. Balança sensível a 1/10 de miligrama.

3.3. Placa de aquecimento ou evaporador de infra-vermelho.

3.4. Forno eléctrico com regulação da temperatura.

3.5. Exsicador.

3.6. Cápsula de platina de 70 mm de diâmetro e 25 mm de altura de fundo plano.4. MODO OPERATÓRIO

Colocar 20 ml de vinho numa cápsula de platina, previamente tarada (Po g). Evaporar em banho de água a 100 °C e aquecer o resíduo numa placa de aquecimento a 200 °C ou debaixo do evaporador de infra-vermelho até à carbonização. Quando o resíduo não emitir vapor, colocar a cápsula no forno eléctrico levado a 525 °C ± 25 °C. Após 15 min. de carbonização, retirar a cápsula do forno, juntar 5 ml de água destilada que se evapora em banho de água ou debaixo do evaporador de infra-vermelho, e aquecer de novo a 525 °C durante dez minutos.

Se a combustão das partículas carbonizadas não for total, recomeçar as operações de lavagem das partículas carbonizadas, de evaporação de água e de incineração.

Em relação aos vinhos ricos em açúcares, recomenda-se a adição de algumas gotas de óleo vegetal puro ao extracto, antes da primeira incineração, para evitar o transbordar do conteúdo.

Após arrefecimento no exsicador, a cápsula é pesada, sendo PIg.

O peso de cinzas correspondente à toma de ensaio é: p = (P1 Po) g.5. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

5.1. Modo de cálculo

O peso p das cinzas expresso em gramas por litro com dois decimais é: P = 50 · p.


10. ALCALINIDADE DAS CINZAS 1. DEFINIÇÃO

Chama-se alcalinidade das cinzas à soma dos catiões, com excepção do amónio, combinados com os ácidos orgânicos do vinho.2. FUNDAMENTO DO MÉTODO

Titulação, em presença de metil-laranja, das cinzas solubilizadas a quente por um excesso conhecido de ácido titulado.3. REAGENTES E MATERIAL

3.1. Solução 0,05 M de ácido sulfúrico (H2SO4).

3.2. Solução 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH).

3.3. Solução de metil-laranja a 0,1 g p. 100 ml em água destilada.

3.4. Banho de água a 100 °C.

4. MODO OPERATÓRIO

Na cápsula de platina que contém as cinzas de 20 ml de vinho, colocar 10 ml de solução 0,05 M de ácido sulfúrico (3.1); colocar num banho de água a 100 °C durante aproximadamente 15 min., esmagando o resíduo com uma vareta de vidro para activar a dissolução. Em seguida, juntar duas gotas de solução de metil-laranja e titular o excesso de ácido sulfúrico com a solução de hidróxido de sódio (3.2) até à viragem do indicador para amarelo.5. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Modo de cálculo

A alcanilidade das cinzas, expressa em miliequivalentes por litro, com um decimal é:

A = 5 (10-n), n = número de mililitros de hidróxido de sódio 0,1 M.


11. CLORETOS 1. FUNDAMENTO DO MÉTODO

Os cloretos são doseados directamente no vinho por potenciometria utilizando o eléctrodo Ag/AgCl.2. APARELHAGEM

2.1. Medidor de pH milivoltímetro graduado de 2 em 2 mV, pelo menos.

2.2. Agitador magnético.

2.3. Eléctrodo Ag/AgCl, com uma solução saturada de nitrato de potássio como electrólito.

2.4. Microbureta graduada em 1/100 de ml.

2.5. Cronómetro.3. REAGENTES

3.1. Solução-padrão de cloretos; dissolvem-se em água destilada 2,1027 g de cloreto de potássio, KCl (max. 0,005 % °Brix), desidratados antes da utilização por conservação durante alguns dias num exsicador; perfazer um litro; 1 ml desta solução contém 1 mg de Cl .

3.2. Solução titulada de nitrato de prata: dissolvem-se 4,7912 g de nitrato prata, AgNO3, para análise e perfaz-se 1 litro com uma solução alcoólica a 10 p. 100 (v/v): 1 ml desta solução corresponde a 1 mg de Cl .

3.3. Ácido nítrico puro a, pelo menos, 65 p. 100 (r20 = 1,40 g/ml).4. MODO OPERATÓRIO

4.1. Introduzem-se 5,0 ml de solução-padrão de cloretos num vaso cilíndrico de 150 ml colocado sobre um agitador magnético, dilui-se até cerca de 100 ml com água destilada e acidifica-se com 1,0 ml de ácido nítrico a 65p. 100, no mínimo. Depois de se mergulhar o eléctrodo, titular, adicionando com a microbureta, a solução titulada de nitrato de prata, agitando moderadamente. As adições efectuadas são de início de 1,00 ml para os quatro primeiros ml; ler os valores correspondentes em milivolts. Seguidamente, adicionar os 2 ml seguintes por fracções de 0,20 ml; por fim, retomar as adições por fracções de 1 ml até que se tenha deitado 10 ml no total. Após cada adição, esperar cerca de 30 s antes de efectuar a leitura dos milivolts correspondentes. Registar os valores obtidos em papel milimétrico, em função dos mililitros de solução titulada correspondentes e determinar o potencial do ponto de equivalência segundo o ponto de inflexão da curva obtida.

4.2. Introduzem-se 5 ml da solução-padrão de cloretos num vaso cilíndrico de 150 ml, bem como 95 ml de água destilada e 1 ml de ácido nítrico a 65 p. 100, no mínimo. Mergulhar o eléctrodo e titular, agitando até à obtenção do potencial do ponto de equivalência. Repete-se esta determinação até que se tenha obtido uma boa concordância dos resultados. É necessário efectuar este controlo antes de cada série de doseamentos de cloretos nas amostras.

4.3. Deitam-se 50 ml de vinho a analisar num vaso cilíndrico de 150 ml. Adicionam-se 50 ml de água destilada e 1 ml de ácido nítrico a, pelo menos, 65 p. 100 e titula-se como indicado em 4.2.5. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

5.1. Cálculos

Se n representar o número de mililitros de solução titulada de nitrato de prata, o teor em cloreto de líquido estudado é:


20 × n expresso em miligramas de Cl por litro,0,5633 × n expresso em miliequivalentes por litro,32,9 × n expresso em miligramas de cloreto de sódio por litro.5.2. Repetibilidade (r):

r = 1,2 mg de Cl por litror = 0,03 mé/lr = 2,0 mg NaCl/l.5.3. Reprodutibilidade (R):

R = 4,1 mg de Cl por litroR = 0,12 mé/lR = 6,8 mg NaCl/l.6. Nota: Doseamento muito preciso

Faz-se utilizando a curva de titulação completa obtida no decurso do doseamento do líquido estudado com a solução-padrão de nitrato de prata.

a) Deitar 50 ml de vinho a analisar num vaso cilíndrico de 150 ml. Adicionar 50 ml de água destilada e 1 ml de ácido nítrico a, pelo menos, 65 p. 100. Titular com a solução de nitrato de prata, procedendo a adições de 0,5 ml em relação às quais se regista o potencial correspondente em milivolts. Deduzir desta primeira titulação o volume aproximado de solução de nitrato de prata necessário

b) Recomeçar o doseamento nas mesmas condições. Em primeiro lugar, proceder a adições de 0,5 ml de solução titulante até que o volume adicionado seja inferior em 1,5 a 2 ml ao volume determinado em a). Proceder de seguida a adições de 0,2 ml; continuar as adições para além do ponto de equivalência aproximadamente detectado, de um modo simétrico, por adição de 0,2 ml, e, depois, de 0,5 ml.

O ponto final do doseamento e o volume de solução de nitrato de prata exactamente gasto é obtido:- quer traçando a curva e determinado o ponto de equivalência,- quer pelo cálculo:sendo:V = volume de solução titulada no ponto de equivalência.V2 = volume de solução titulada antes do maior salto de potencial.D Vi = volume constante adicionado das fracções de solução titulada, ou seja 0,2 ml.DD E1 = segunda diferença de potencial antes da maior variação do potencial.DD E2 = segunda diferença de potencial depois da maior variação do potencial.


Exemplo:

Volume de solução titulada de AgNO3Potencial E em mVDiferença DESegunda diferença DDE 0204 4 0,2208 0 4 0,4212 2 6 0,6218 0 6 0,8224 0 6 1,0230 2 8 1,2238 4 12 1,4250 10 22 1,6272 22 44 1,8316 10 34 2,0350 8 26 2,2376 6 20 2,4396

Neste exemplo, o ponto final da titulação situa-se entre 1,6 e 1,8 ml: pois é neste intervalo que aparece o maior salto de potencial (DE = 44 mV). O volume de solução titulada de nitrato de prata consumido para dosear os cloretos na toma de ensaio é:


12. SULFATOS 1. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS

1.1. Método de referência

Precipitação do sulfato de bário e pesagem. O fosfato de bário precipitado nas mesmas condições é eliminado através de uma lavagem do precipitado com ácido clorídrico.

No caso dos mostos ou dos vinhos ricos em dióxido de enxofre, deve ser realizada uma dessulfitagem prévia por ebulição ao abrigo do ar.1.2. Método rápido de ensaio

Classificação dos vinhos em várias categorias pelo método dito dos limites, baseado na precipitação do sulfato de bário mediante utilização de uma solução titulada do ião bário.2. MÉTODO DE REFERÊNCIA

2.1. Reagentes

2.1.1. Ácido clorídrico em solução 2 M.

2.1.2. Cloreto de bário em solução a 200 g/l de BaCl2, 2H2O.2.2. Modo operatório

2.2.1. Caso geral

Deitar 40 ml da amostra a analisar num tubo de centrifugação de 50 ml; adicionar 2 ml de ácido clorídrico 2 M e 2 ml de solução de cloreto de bário a 200 g/l; agitar com uma vareta de vidro; lavar a vareta com um pouco de água destilada e deixar em repouso durante 5 minutos. Centrifugar durante 5 min. e, depois, decantar com precaução o líquido sobrenadante.

De seguida, lavar o precipitado de sulfato de bário procedendo do seguinte modo: adicionar 10 ml de ácido clorídrico 2 M, colocar o precipitado em suspensão e centrifugar durante 5 min. Separar com precaução o líquido sobrenadante. Repetir duas vezes a lavagem do precipitado nas mesmas condições com 15 ml de água destilada de cada vez.

Transvasar quantitativamente, lavando com água destilada, o precipitado para uma cápsula de platina tarada que se coloca sobre um banho de água a 100 °C até evaporação a seco. O precipitado seco é calcinado várias vezes durante pouco tempo sobre uma chama até à obtenção de um resíduo branco. Deixar arrefecer num exsicador e pesar.

Sendo m a massa em miligramas de sulfato de bário obtida.2.2.2. Caso particular:mostos sulfitados e vinho com elevado teor em dióxido de enxofre

Realizar previamente à eliminação do dióxido de enxofre.

Num balão cónico de 500 ml, munido de uma ampola com torneira e de um tubo de escape, introduzir 25 ml de água e 1 ml de ácido clorídrico puro (r20 = 1,15 1,18 g/ml). Levar esta solução à ebulição para expulsar o ar e introduzir 100 ml de vinho pela ampola com torneira, mantendo a solução em ebulição. Prosseguir a ebulição até que o volume de líquido contido no balão cónico esteja reduzido a cerca de 75 ml; transvasar quantitativamente, após arrefecimento, para um balão graduado de 100 ml. Completar até ao traço de referência com água. Proceder ao doseamento dos sulfatos a partir duma toma de ensaio de 40 ml, tal como indicado em 2.2.1.
2.3. Expressão dos resultados

2.3.1. Cálculos

O teor em sulfatos, expresso em miligramas por litro de sulfato de potássio, K2SO4, é:18,67 × m.

O teor do mosto ou do vinho em sulfatos é expresso em miligramas por litro de sulfato de potássio, sem decimal.2.3.2. Repetibilidade:

até 1 000 mg/l : r = 27 mg/lcerca de 1 500 mg/l : r = 41 mg/l.2.3.3. Reprodutibilidade:

até 1 000 mg/l : R = 51 mg/lcerca de 1 500 mg/l : R = 81 mg/l.3. MÉTODO RÁPIDO DE ENSAIO

3.1. Reagentes

3.1.1. Solução titulada de cloreto de bário

Dissolvem-se 2,804 g de cloreto de bário, BaCl2, 2H2O, e 10 ml de ácido clorídrico (r20 = 1,15 a 1,18 g/ml) numa quantidade de água suficiente para obter 1 litro de solução; 1 ml desta solução precipita uma quantidade de iões sulfato equivalente a 2 mg de sulfato de potássio.

3.1.2. Ácido sulfúrico (r20 = 1,84 g/ml) em solução diluída 1/10 (m/v).3.2. Modo operatório

Em três tubos de ensaio, deitar 10 ml de mosto ou de vinho; adicionar ao tubono 1: 3,5 ml, ao no 2: 5 ml e ao no 3: 10 ml da solução de cloreto de bário. Agitar e levar à ebulição; deixar repousar uma a duas horas. O líquido de cada tubo, decantado, é filtrado e dividido em duas partes. A uma, adicionar algumas gotas da solução diluída de ácido sulfúrico, à outra adicionar algumas gotas da solução de cloreto de bário. Examinar cada tubo e anotar a sua limpidez ou o seu aspecto turvo. A interpretação é dada no quadro seguinte.


VinhoCloreto de bárioVinho filtrado +ácido sulfúrico diluídosolução de cloreto de bário1o ensaio(ml)(ml)turvolímpido103,5(menos de 0,7 g K2SO4/l)
límpido turvo
(mais de 0,7 g K2SO4/l)2o ensaio105turvolímpido(menos de 1 g K2SO4/l)
límpido turvo
(mais de 1 g K2SO4/l)3o ensaio1010turvolímpido(menos de 2 g K2SO4/l)
límpido turvo
(mais de 2 g K2SO4/l)


13. ACIDEZ TOTAL 1. DEFINIÇÃO

A acidez total do vinho é a soma dos ácidos tituláveis quando se leva o pH do vinho a 7 por adição de uma solução alcalina titulada.

O dióxido de carbono não está incluído na acidez total.2. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Titulação potenciométrica, ou titulação em presença de azul de bromotimol, como indicador do fim da reacção, por comparação com um padrão de cor.3. REAGENTES

3.1. Solução tampão pH 7,0:Fosfato monopotássico KH2PO4 : 107,3 g
Solução M de hidróxido de sódio (NaOH) : 500 ml,
Água q.b. para : 1 000 ml.

As soluções tampão de referência comerciais podem igualmente ser utilizadas.

3.2. Solução 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH).

3.3. Solução de azul de bromotimol a 4 g/l.

Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S)4 gÁlcool neutro a 96 % vol. 200 mlApós solubilidade, juntar:Água isenta de CO2 200 mlSolução M de hidróxido de sódioq.b. para coloração azul-verde (pH 7) 7,5 mlÁgua q.b. para1 000 ml4. APARELHAGEM

4.1. Trompa de vácuo de água.

4.2. Balão de vácuo de 500 ml.

4.3. Potenciómetro de escala calibrada em unidades pH e eléctrodos. O electródio de vidro deve ser conservado em água destilada. O eléctrodos de calomel-cloreto de potássio saturado deve ser conservado numa solução saturada de cloreto de potássio. Um eléctrodos combinado é o mais frequentemente utilizado; deve conservar-se em água destilada.

4.4. Vaso cilíndrico de 50 ml de capacidade (caso dos vinhos) e de 100 ml de capacidade (caso dos mostos concentrados rectificados).5. MODO OPERATÓRIO

5.1. Preparação da amostra

5.1.1. Caso dos vinhos

Eliminação do dióxido de carbono. Colocar cerca de 50 ml de vinho num balão de vácuo; agitar e, simultaneamente, fazer o vácuo por meio da trompa de vácuo de água. A agitação deve durar 1 a 2 min.
5.1.2. Caso dos mostos concentrados rectificados

Introduzir 20 ml de mosto concentrado rectificado, pesado exactamente, num balão aferido de 500 ml. Completar com água até ao traço. Homogeneizar.5.2. Titulação potenciométrica

5.2.1. Calibração do potenciómetro

A calibração do potenciómetro faz-se a 20 °C seguindo as indicações dadas para o aparelho utilizado com a solução-tampão de pH 7,00 a 20 °C.5.2.2. Técnica de uma medição

Num vaso cílindrico (4.4) colocar um volume de amostra preparado como indicado em 5.1, igual a 10 ml no caso do vinho e a 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Juntar aproximadamente 10 ml de água destilada e deitar por meio de bureta a solução 0,1 M de hidróxido de sódio (3.2) até que o pH seja igual a 7,0 a 20 °C. A adição do licor alcalino deve ser efectuada lentamente e a solução agitada de um modo constante. Seja n o número de mililitros de NaOH 0,1 M adicionados.5.3. Titulação com indicador (azul de bromotimol)

5.3.1.Ensaio prévio: estabelecimento do padrão de cor

Num vaso cilíndrico (4.4), deitar 25 ml de água destilada fervida, 1 ml de solução de azul de bromotimol (3.3) e um volume de amostra preparado como indicado em 5.1, igual a 10 ml no caso do vinho e a 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Adicionar a solução 0,1 M de hidróxido de sódio (3.2) até à obtenção de uma coloração azul-verde. Juntar 5 ml da solução-tampão pH 7 (3.1).5.3.2. Dosagem

Num vaso cilíndrico (4.4), deitar 30 ml de água destilada fervida, 1 ml de solução de azul de bromotimol (3.3) e um volume preparado como indicado em 5.1, igual a 10 ml no caso do vinho e a 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Adicionar a solução 0,1 m de hidróxido de sódio (3.2) até à obtenção de uma coloração idêntica à obtida no ensaio prévio (5.3.1). Seja n o número de mililitros de solução de hidróxido de sódio 0,1 M adicionados.6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1. Modo de cálculo

6.1.1. Caso dos vinhos

A acidez total, expressa em miliequivalentes por litro, será:

A = 10 n.É expressa com um decimal.A acidez total, expressa em gramas de ácido tartárico por litro, será:

A2 = 0,075 · AÉ dada com um decimal.6.1.2. Caso dos mostos concentrados rectificados

- Acidez total expressa em miliequivalentes por quilo de mosto concentrado rectificado: a = 5 · n.
- Acidez total expressa em miliequivalentes por quilo de açúcares totais:P = teor p. 100 (m/m) de açúcares totais.
É expressa com um decimal.6.2. Repetibilidade (r) para a titulação com indicador

r = 0,9 me/lr = 0,07 g de ácido tartárico/lpara vinhos brancos, rosados e tintos.6.3.Reprodutibilidade (R): para a titulação com indicador (5.3)

Para os vinhos brancos e rosados:R = 3,6 me/lR = 0,3 g de ácido tartárico/l.

Para os vinhos tintos:R = 5,1 me/lR = 0,4 g de ácido tartárico/l.


14. ACIDEZ VOLÁTIL 1. DEFINIÇÃO

A acidez volátil é constituída pelos ácidos que pertencem à série acética e que se encontram no vinho quer no estado livre quer sob a forma de sais.2. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Titulação dos ácidos voláteis, separados do vinho, por arrastamento com vapor de água e rectificação dos vapores.

O vinho é previamente desembaraçado do dióxido de carbono.

A acidez do dióxido de enxofre livre e do dióxido de enxofre combinado destilado nestas condições deve ser descontada da acidez do destilado.

A acidez do ácido sórbico eventualmente adicionado ao vinho deve igualmente ser descontada.

Nota: O ácido salicílico utilizado em alguns países para estabilizar os vinhos previamente à análise, encontra-se em parte no destilado. É necessário doseá-lo e descontá-lo na acidez. O método de doseamento é dado no no 7 deste capítulo.3. REAGENTES

3.1. Ácido tartárico cristalizado (C4H6O6)

3.2. Solução 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH)

3.3. Solução de fenolftaleína a 1 por 100 em álcool a 96 % vol. neutro

3.4. Ácido clorídrico (r20 = 1,18 a 1,19 g/ml) diluído ¼ (v/v)

3.5. Solução 0,005 M de iodo (I2)

3.6. Iodeto de potássio cristalizado (KI)

3.7. Goma de amido a 5 g/lDissolver 5 g de amido em aproximadamente 500 ml de água. Levar à ebulição, agitando e mantendo a ebulição durante 10 minutos; adicionar 200 g de cloreto de sódio. Levar o volume ao litro depois de arrefecer.

3.8. Solução saturada de borato de sódio (Na2B4O7, 10 H2O), aproximadamente 55 g/l a 20 °C4. APARELHOS

4.1. Aparelho de arrastamento de vapor de água composto por:1. Um gerador de vapor de água; o vapor de água produzido deve estar isento de dióxido de carbono;2. Um borbulhador;3. Uma coluna rectificadora;4. Um refrigerante.Este aparelho deve corresponder aos três ensaios seguintes:a) Colocar no borbulhador 20 ml de água fervida; recolher 250 ml de destilado e adicionar 0,1 ml de solução 0,1 M de hidróxido de sódio (3.2) e 2 gotas de solução de fenolftaleína (3.3), a coloração rosa deve ser estável durante, pelo menos, 10 segundos (vapor de água isento de dióxido de carbono).b) Colocar no borbulhador 20 ml de uma solução 0,1 M de ácido acético. Recolher 250 ml de destilado. Titular com a solução 0,1 M de hidróxido de sódio (3.2). O volume empregue deve ser inferior ou igual a 19,9 ml. (Ácido acético arrastado F 99,5 %.)
c) Colocar no borbulhador 20 ml de uma solução M de ácido láctico. Recolher 250 ml de destilado e titular com a solução 0,1 M de hidróxido de sódio (3.2). O volume empregue deve ser inferior ou igual a 1,0 ml. (Ácido láctico destiladoE 0,5 %.)Qualquer aparelho ou técnica que satisfaça estes ensaios constitui um aparelho ou uma técnica oficial internacional.

4.2. Trompa de vácuo de água

4.3. Balão de vácuo5. MODO OPERATÓRIO

5.1. Preparação da amostra:eliminação do dióxido de carbono. Colocar cerca de 50 ml de vinho num balão de vácuo; agitar e, simultâneamente, fazer o vácuo por meio de uma trompa de vácuo de água. A agitação deve durar 1 a 2 min.5.2. Arrastamento por vapor de água

Colocar no borbulhador 20 ml de vinho ao qual foi retirado o dióxido de carbono como indicado em 5.1. Juntar aproximadamente 0,5 g de ácido tartárico (3.1). Recolher pelo menos 250 ml de destilado.5.3. Titulação

Titular com a solução 0,1 M de hidróxido de sódio (3.2) em presença de duas gotas de solução de fenolftaleína (3.3), sendo n ml o volume utilizado.

Adicionar 4 gotas de ácido clorídrico diluído ¼ (3.4), 2 ml de goma de amido (3.7) e alguns cristais de iodeto de potássio (3.6). Titular o dióxido de enxofre livre com a solução 0,005 M de iodo (3.5), sendo n2 ml o volume empregue.

Juntar a solução saturada de borato de sódio (3.8) até ao reaparecimento da coloração rosa. Titular o dióxido de enxofre combinado com a solução 0,005 M de iodo (3.5), sendo n" ml o volume empregue.6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1. Modo de cálculo

A acidez volátil expressa em miliequivalentes por litro, com um decimal, será:A = 5 (n 0,1 n2 0,05 n").

A acidez volátil, expressa em g de ácido acético por litro, com dois decimais, será:0,300 (n 0,1 n2 0,05 n").6.2. Repetibilidade (r)

r = 0,7 mé/lr = 0,04 g de ácido acético/l.6.3.Reprodutibilidade (R)

R = 1,3 mé/lR = 0,08 g de ácido acético/l.
6.4. Caso de um vinho adicionado de ácido sórbico

Dado que o ácido sórbico é susceptível de arrastamento pelo vapor de água a 96 % para um volume de destilado de 250 ml, a sua acidez deve ser deduzida da acidez volátil, tendo em conta que 100 mg de ácido sórbico correspondem a uma acidez de 0,89 miliequivalentes ou a 0,053 g de ácido acético e conhecendo o teor de ácido sórbico (mg/l) determinado pelo método correspondente.7. DOSAGEM DO ÁCIDO SALICÍLICO ARRASTADO NO DESTILADO DA ACIDEZ VOLÁTIL

7.1. Fundamento

Após dosagem da acidez volátil e correcção do dióxido de enxofre, a presença do ácido salicílico é caracterizada, após acidificação, pela coloração violeta que surge pela adição de um sal de ferro III.

A dosagem do ácido salicílico arrastado com a acidez volátil para o destilado é efectuada num segundo destilado, de volume igual àquele com que foi feita a dosagem da acidez volátil. Neste destilado, o ácido salicílico é doseado por um método colorimétrico de comparação, sendo depois deduzido da acidez do destilado da acidez volátil.7.2. Reagentes

7.2.1. Ácido clorídrico (HCL) (r20 = 1,18 à 1,19 g/ml)

7.2.2. Tiossulfato de sódio (Na2S2O3, 5 H2O) 0,1 M

7.2.3. Solução de sulfato de ferro III e de amónia [Fe2(SO4)3, (NH4)2SO4. 24 H2O] a 10 p. 100 (m/v)

7.2.4. Solução de salicilato de sódio 0,01 M. Solução contendo 1,60 g/l de salicilato de sódio (NaC7H5O3)7.3. Modo operatório

7.3.1. Caracterização do ácido salicílico no destilado da acidez volátil

Imediatamente após dosagem da acidez volátil e à correcção do dióxido de enxofre livre e combinado, juntar no balão cónico 0,5 ml de ácido clorídrico (7.2.1), 3 ml da solução 0,1 M de tiossulfato de sódio (7.2.2) e 1 ml da solução de sulfato de ferro III e de amónia (7.2.3).

Em presença de ácido salicílico, surge uma coloração violeta.7.3.2. Dosagem do ácido salicílico

No balão cónico mencionado anteriormente, marcar com um traço de referência o volume de destilado. Esvaziar e lavar o balão.

Submeter uma nova toma de 20 ml de vinho ao arrastamento com vapor de água e recolher o destilado no balão cónico até ao traço de referência. Juntar 0,3 ml de ácido clorídrico puro (7.2.1) e 1 ml da solução de sulfato de ferro III e de amónia (7.2.3). O conteúdo do balão cónico adquire uma coloração violeta.

Num balão cónico idêntico ao balão com o traço de referência, deitar águar destilada até ao mesmo nível que o do destilado. Juntar 0,3 ml de ácido clorídrico puro (7.2.1) e 1 ml de solução de sulfato de ferro III e de amónia (7.2.3). Deitar por meio de bureta a solução de salicilato de sódio 0,01 M (7.2.4) até à obtenção de uma coloração violeta da mesma intensidade que a do balão cónico que contém o destilado de vinho.

Seja n4 o número de mililitros gastos.
7.4. Correcção da acidez volátil

Subtrair o volume 0,1 · n4 ml do volume n ml de solução de hidróxido de sódio 0,1 M utilizada para titular a acidez do destilado usado na dosagem da acidez volátil.


15. ACIDEZ FIXA 1. PRINCÍPIO

A acidez fixa é determinada pela diferença entre a acidez total e a acidez volátil.2. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

A acidez fixa é expressa:- Em miliequivalentes por litro;- Em gramas de ácido tartárico por litro.


16. ÁCIDO TARTÁRICO 1. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS

1.1. Método de referência

O ácido tartárico, precipitado sob a forma de racemato de cálcio, é doseado por gravimetria. Este doseamento pode ser completado por um doseamento volumétrico de comparação. As condições de precipitação- pH, volume total empregado, concentração dos iões precipitantes- são tais que a precipitação do racemato de cálcio é total, enquanto que o D.( ) tartarato de cálcio fica em solução.

Quando o vinho tiver sido adicionado de ácido metatartárico, este deverá ser previamente hidrolizado, pois induz a uma precipitação incompleta do racemato de cálcio.1.2.Método usual

O ácido tartárico, isolado com a ajuda de uma coluna permutadora de aniões, é doseado colorimetricamente no eluído, graças à coloração vermelha que produz em reacção com o ácido vanádico. Este eluído contém ainda ácido málico e ácido láctico que não são interferentes.2. MÉTODO DE REFERÊNCIA

2.1. Método ponderal

2.1.1. Reagentes

2.1.1.1. Solução de acetato de cálcio contendo 10 g/l de cálcio Carbonato de cálcio puro: Ca CO325 gÁcido acético (CH3 COOH) (r20 = 1,05 g/ml)40 mlÁgua, q.b. para: 1 l

2.1.1.2. Racemato de cálcio cristalizado: Ca C4 O6 H4 , 4H2ONum vaso cilíndrico de 400 ml, introduzir 20 ml de uma solução de ácido L (+) tartárico a 5 g/l, 20 ml de uma solução de D ( ) tartarato de amónio a 6,126 g/l e 6 ml da solução de acetato de cálcio a 10 g/l de cálcio (2.1.1.1).Deixar precipitar durante duas horas. Recolher o precipitado sobre um cadinho filtrante de porosidadeno 4, lavá-lo três vezes com 30 ml de água destilada (aproximadamente). Secar na estufa a 70 °C até peso constante. Com as quantidades de reagente utilizadas, obtêm-se aproximadamente 340 mg de racemato de cálcio cristalizado.

Conservar num frasco tapado.


2.1.1.3. Licor de precipitação (pH 4,75)- ácido D ( ) tartárico 122 mg- Hidróxido de amónio (r20 = 0,97 g/ml)
diluído a 25 % (v/v) 0,3 ml- solução de acetato de cálcio a 10 g por litro 8,8 ml- Água q.b.:1 000 ml

Dissolver o ácido D ( ) tartárico e adicionar o hidróxido de amónio; levar o volume aproximadamente a 900 ml; adicionar 8,8 ml de solução de acetato de cálcio (2.1.1.1) e, depois de misturar, ajustar o pH a 4,75 com ácido acético.

Acertar o litro.

O racemato de cálcio, sendo ligeiramente solúvel neste licor, convém aí introduzir 5 mg de racemato de cálcio por litro, submetê-lo a agitação durante 12 h e filtrá-lo.2.1.2. Modo operatório

2.1.2.1. Caso dos vinhos não adicionados de ácido metatartárico

Num vaso cilíndrico de 600 ml, colocar 500 ml de licor de precipitação e 10 ml de vinho. Misturar, friccionando as paredes do vaso com a extremidade de uma vareta de vidro. Deixar precipitar durante 12 horas (uma noite).

Filtrar por um cadinho filtrante, de porosidade no 4, tarado e disposto sobre um balão de vácuo limpo, arrastando o precipitado. Lavar o frasco onde se efectuou a precipitação com o filtrado e arrastar as últimas partículas de precipitado.

Secar na estufa a 70 °C até peso constante. Pesar, sendo p o peso de racemato de cálcio Ca C4O6H4 cristalizado com 4 moléculas de água.2.1.2.2. Caso dos vinhos adicionados de ácido metatartárico

Quando se trabalha com um vinho a que foi adicionado ácido metatartárico ou quando se suspeita desta adição, deve proceder-se à hidrólise do ácido nas condições seguintes.

Num balão cónico de 50 ml, colocar 10 ml de vinho e 0,4 ml de ácido acético puro (CH3 COOH, r20 = 1,05 g/ml). Fechar o balão com uma rolha munida de um descarregador e levar à ebulição durante 30 minutos.

Depois de arrefecer, transvasar o líquido contido no balão cónico para um vaso cilíndrico; enxaguar o balão cónico 2 vezes com 5 ml de água e continuar como está indicado no modo acima referido.

No resultado do doseamento, o ácido metatartárico é contabilizado como ácido tartárico.2.1.3. Expressão dos resultados

Uma molécula de racemato de cálcio corresponde a meia molécula de ácido L (+) tartárico do vinho.

A quantidade de ácido tartárico por litro de vinho, expressa em miliequivalentes, é igual a: 384,5 p.

Ela é dada com uma casa decimal.

A quantidade de ácido tartárico por litro de vinho expresso em gramas de ácido tartárico, é igual a: 28,84 p.

Ela é dada com uma casa decimal.

A quantidade de ácido tartárico por litro de vinho, expressa em gramas de tartarato ácido de potássio, é igual a: 36,15 p.


Ela é dada com uma casa decimal.2.2. Doseamento volumétrico de comparação

2.2.1. Reagentes

2.2.1.1. Ácido clorídrico (HCL) (r20 = 1,18 a 1,19 g/ml) diluído a 1/5 (v/v).

2.2.1.2. Solução de EDTA 0,05 MEDTA (sal dissódico bihidratado do ácido etilenodiamino-tetracético (C10H14N2O8Na2, 2H2O) 18,61 gÁgua destilada q.b.1 000 ml

2.2.1.3. Solução de hidróxido de sódio a 40 % (m/v)Hidróxido de sódio (NaOH) 40 gÁgua destilada q.b. 100 ml

2.2.1.4. Indicador complexométrico com ácido calcon-carbónico: 1 % (m/m)Ácido calcon-carbónico ou ácido 2-hidroxi-4-sulfo-1-naftilazo-3-naftoico (C21H14N2O7S,3H2O) 1 gSulfato de sódio anidro (Na2SO4)100 g2.2.2. Modo operatório

Após pesagem, colocar de novo o cadinho filtrante contendo o racemato de cálcio no balão de vácuo. Dissolver o precipitado com 10 ml de ácido clorídrico diluído (2.2.1.1). Lavar o cadinho com 50 ml de água destilada.

Adicionar 5 ml da solução de hidróxido de sódio a 40 % (2.2.1.3) e cerca de 30 mg do indicador (2.2.1.4). Titular com EDTA 0,05 M (2.2.1.2). Seja n o número de mililitros gastos.2.2.3. Expressão de resultados

A quantidade de ácido tartárico por litro de vinho, expresso em miliequivalentes, é igual a: 5 n.

É dada com um decimal.

A quantidade de ácido tartárico por litro de vinho, expressa em gramas de ácido tartárico, é igual a: 0,375 n.

É dada com um decimal.

A quantidade de ácido tartárico por litro de vinho, expressa em gramas de tartarato ácido de potássio, é igual a: 0,470 n.

É dada com um decimal.3. MÉTODO USUAL

3.1. Reagentes

3.1.1. Para o tratamento preliminar do vinho

3.1.1.1. Ácido acético (CH3 COOH r20 = 1,05 g/ml) diluído a 30 p. 100 (v/v).

3.1.1.2. Permutador de aniões de forte basicidade (ex: permutador de aniões III da Merck de 20-50 mesh) sob a forma de acetato. Preparar uma suspensão do permutador (100 g aproximadamente) em 200 ml de ácido acético diluído a 30 % (3.1.1.1); deixar em contacto, pelo menos, 24 h antes de o utilizar. Conservar o permutador em ácido acético diluído a 30 p. 100 até doseamentos posteriores.

3.1.1.3. Ácido acético (CH3 COOH r20 = 1,05 g/ml) diluído a 0,5 p. 100 (v/v).

3.1.1.4. Solução de sulfato de sódio a 7,1 g p. 100 ml (0,5 M)

Dissolver 71 g de sulfato de sódio (Na2SO4) anidro em água destilada e perfazer o volume de 1 000 ml com água destilada.3.1.2. Para o doseamento do ácido tartárico:

3.1.2.1. Solução de acetato de sódio (Na CH3COO) a 27 p. 100 (m/v)

Dissolver 270 g de acetato de sódio anidro, Na CH3 COO, em água destilada e completar até ao volume de 1 000 ml.

3.1.2.2. Reagente vanádico

Dissolver 10 g de meta-vanadato de amónio, (NH4 VO3), em 150 ml de solução de hidróxido de sódio M (3.1.2.10). Transvasar esta solução para um balão graduado de 500 ml e juntar 200 ml da solução de acetato de sódio a 27 p. 100 (3.1.2.1). Levar o volume a 500 ml com água destilada.

3.1.2.3. Solução de H2 SO4 1 M

3.1.2.4. Solução de H2 SO4 0,5 M

3.1.2.5. Solução de H2 SO4 0,05 M

3.1.2.6. Solução de ácido periódico 0,05 M

Num balão graduado de 1 000 ml, introduzir 10,696 g de periodato de sódio Na IO4, 50 ml de ácido sulfúrico 0,5 M (3.1.2.4) e completar até 1 000 ml com água destilada.

3.1.2.7. Solução de glicerol a 10 p. 100 (m/v)

Num balão graduado de 100 ml, colocar 10 g de glicerol C3H8O3; completar até 100 ml com água destilada.

3.1.2.8. Solução de sulfato de sódio a 7,1 gp. 100 ml (ver 3.1.1.4)

3.1.2.9. Solução de ácido tartárico a 1 g/l

Num balão graduado de 500 ml, introduzir 0,5 g de ácido tartárico, 6,66 ml de solução de hidróxido de sódio M (3.1.2.10) e completar até 500 ml com a solução de sulfato de sódio a 7,1 p. 100 (ver 3.1.1.4).

3.1.2.10. Solução de hidróxido de sódio, NaOH, 1M.3.2. Aparelhagem

3.2.1. Coluna de vidro de 300 mm, aproximadamente, de comprimento e 10-11 mm de diâmetro interno, munida de uma torneira.

3.2.2. Espectrofotómetro que permita a medição da absorvência no comprimento de onda de 490 nm, com cubas de 10 mm de trajecto óptico.3.3. Modo operatório

3.3.1. Preparação da coluna permutadora de iões

Colocar na coluna de vidro, acima da torneira (3.2.1), um tampão de algodão de vidro. Impregnar este tampão com água destilada. Deitar na coluna 10 ml da suspensão do per mutador de iões na fase acetato (3.1.1.2). Deixar decantar. Colocar um tampão de algodão de vidro na superfície do permutador depositado (de modo a evitar, no decurso das lavagens posteriores, que o permutador entre de novo em suspensão).

O permutador deve ser utilizado apenas numa única operação.3.3.2. Isolamento dos ácidos orgânicos

Uma vez aberta a torneira, deixar correr a solução de ácido acético até aproximadamente 2-3 mm acima do tampão de algodão de vidro, colocado acima do permutador.

Juntar 10 ml de solução de ácido acético a 0,5 p. 100 (3.1.1.3) e deixar depois correr o líquido até ao mesmo nível da operação anterior. Repetir 4 vezes esta operação de lavagem.

Após a última lavagem, fechar a torneira e deitar, sobre o permutador, 10 ml de vinho ou de mosto. Deixar o vinho escoar gota a gota (débito médio de 1 gota/segundo) e parar o escoamento exactamente acima do permutador. Deitar de novo, na coluna, 10 ml de solução de ácido acético a 0,5/100 (3.1.1.3), deixar escoar à mesma velocidade da operação anterior e repetir 7 vezes a operação de lavagem, utilizando 10 ml de água de cada vez. Na última lavagem, fechar a torneira logo que o nível do líquido se encontre um pouco acima do tampão de algodão de vidro superior.

Eluir os ácidos fixados no permutador com a solução de sulfato de sódio a 7,1/100 (3.1.1.4), recolher o eluído, num balão graduado de 100 ml, até ao traço de referência.3.3.3. Dosagem do ácido tartárico

3.3.3.1. Caso dos vinhos aos quais não foi adicionado ácido metatartárico

O balão a é utilizado no doseamento, enquanto o balão b, no qual o ácido tartárico é destruído pelo ácido periódico, constitui a testemunha.

Introduzir no balãoa:- 2 ml de H2 SO4 M (3.1.2.3)- 5 ml de H2 SO4 0,05 M (3.1.2.5)- 1 ml de glicerol a 10 p. 100 (3.1.2.7).

Introduzir no balão b:- 2 ml de H2 SO4 M (3.1.2.3)- 5 ml de solução de ácido periódico 0,05 M (3.1.2.6)

Após 15 minutos juntar:- 1 ml de solução de glicerol a 10 p. 100 (3.1.2.7) para destruir o excesso de ácido periódico.

Esperar 2 min.

Deitar, agitando, primeiro no balão be depois no balão a, 5 ml de reagente vanádico (3.1.2.2). Ligar imediatamente um cronómetro e colocar o conteúdo dos balões a e b nas cubas do espectrofotómetro. Passados 90 segundos, medir a absorvência a 490 nm do líquido proveniente do balão a (doseamento) em relação à testemunha (balão b).

Se o eluído é muito rico em ácido tartárico e se a absorvência for muito elevada, diluir o eluído com a solução de sulfato de sódio a 7,1 p. 100 e proceder à medição sobre a solução diluída.
3.3.3.2. Caso dos vinhos aos quais foi adicionado ácido metatartárico

No caso de um vinho ao qual foi adicionado ácido metatartárico, ou se se suspeitar dessa adição, proceder à hidrólise deste ácido como é indicado no método de referência.

Após arrefecimento, o conteúdo do balão cónico é introduzido na coluna do que contém o permutador, bem como as águas de lavagem do balão (2 vezes 5 ml).

Continuar como está indicado anteriormente.

No resultado do doseamento, o ácido metatartárico é contabilizado como ácido tartárico.3.3.4. Determinação da curva de calibração

Introduzir 10, 20, 30, 20 e 50 ml da solução de ácido tartárico a 1 g/l (3.1.2.9) em balões graduados de 100 ml e completar até 100 ml com a solução de sulfato de sódio a 7,1p. 100 ml (3.1.1.4). As concentrações destas soluções correspondem aos eluídos obtidos a partir de vinhos que contenham 1, 2, 3, 4 e 5 g de ácido tartárico por litro.

Em 2 balões cónicos a e b,introduzir 20 ml destas soluções e continuar como indicado para o eluído do vinho.

A representação gráfica das absorvências destas soluções, em função do teor de ácido tartárico, é uma recta que curva ligeiramente para o ponto zero. Especificar, se necessário, esta parte da curva, submetendo-a à medição de soluções de título exactamente conhecido inferior a 1,0 g/l.3.3.5. Expressão dos resultados

Relacionar a absorvência medida para o eluído, utilizando a curva de calibração para obter o teor de ácido tartárico no vinho, expresso em gramas por litro.

Este teor é expresso com 1 decimal.


17. ÁCIDO CÍTRICO 1. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O ácido cítrico é transformado em oxaloacetato e acetato numa reacção catalizada pela citrato-liase (CL):citrato oxaloacetato + acetato

Na presença da malato-desidrogenase (MDH) e da lactato-desidrogenase (LDH), o oxaloacetato e o seu derivado de descarboxilação, o piruvato, são reduzidos em L-malato e L-lactato pelo nicotinamida-adenina-dinucleótido reduzido (NADH):Oxaloacetato + NADH + H+ L-malato + NAD+Piruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+

Nestas reacções, a quantidade de NADH oxidado em NAD+ é proporcional ao citrato presente. A oxidação do NADH é medida pela diminuição da sua absorvência no comprimento de onda 340 nm.2. REAGENTES

2.1. Tampão pH 7,8
(glicilglicina 0,51 M; pH 7,8; Zn2+: 0,6 · 10 3 M)Dissolver 7,13 g de glicilglicina em aproximadamente 70 ml de água bidestilada; ajustar o pH a 7,8, com cerca de 13 ml de solução de hidróxido de sódio NaOH 5 M; juntar 10 ml de solução de cloreto de zinco ZnCl2, de 80 mg em 100 ml e levar a 100 ml com água bidestilada.

A solução permanece estável durante pelo menos 4 semanas a + 4 °C.

2.2. Solução de nicotinamida-adenina-dinucleótido reduzida (NADH), aproximadamente 6.10 3 M. Dissolver 30 mg NADH e 60 mg NaHCO3 em 6 ml de água bidestilada.

2.3. Solução de malato desidrogenase/lactato desidrogenase, (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml). Mistura-se 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml de solução de sulfato de amónio (3,2 M) e 0,5 ml LDH (5 mg/ml).

Esta suspensão é estável durante pelo menos um ano a + 4 °C.

2.4. Citrato-liase CL (5 mg de proteína/ml). Dissolver 168 mg do liofilizado em 1 ml de água gelada.

A solução é estável durante pelo menos uma semana a + 4 °C e durante pelo menos 4 semanas na forma congelada.

Recomenda-se que se proceda, previamente ao doseamento, à verificação da actividade da enzima.

2.5. Polivinilpolipirrolidona (PVPP)

Nota: O conjunto dos reagentes necessários para este doseamento, estão comercializados.3. APARELHAGEM

3.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medições a 340 nm, máximo de absorção do NADH

Na sua ausência, fotómetro de espectro descontínuo que permita efectuar as medições a 334 nm ou a 365 nm. Dado tratar-se de medições absolutas de absorvência (sem série de calibragens, mas com referência ao coeficiente de extinção do NADH), as escalas dos comprimentos de onda e das absorvências do aparelho devem ser controladas.

3.2. Cubas de vidro de 1 cm de trajecto óptico ou cubas de utilização única

3.3. Micropipetas que permitam recolher volumes compreendidos entre 0,02 e 2 ml
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

De um modo geral, o doseamento do citrato efectua-se directamente no vinho sem descoloração prévia nem diluição, desde que o teor de ácido cítrico seja inferior a 400 mg/l. Caso contrário, proceder à diluição do vinho de modo a que a concentração em citrato se situe entre 20 e 400 mg/l (quantidade de citrato na toma de ensaio compreendida entre 5 µg e 80 µg).

No caso de um vinho tinto rico em compostos fenólicos, é aconselhável tratá-lo previamente pela PVPP:

Colocar em suspensão em água 0,2 g de PVPP, aproximadamente, deixar repousar 15 minutos. Filtrar através de um filtro plissado.

Juntar a 10 ml de vinho colocado num balão cónico de 50 ml o PVPP húmido tirado com uma espátula do filtro. Agitar durante 2 a 3 minutos. Filtrar.5. MODO OPERATÓRIO

Dado o espectrofotómetro ser regulado no comprimento de onda de 340 nm, as medições da absorvência são feitas em cubas de 1 cm, sendo a absorvência zero regulada em relação ao ar (sem cuba no trajecto óptico). Introduzir nas cubas de 1 cm de espessura:

Testemunha DosagemSolução 2.11,00 ml 1,00 mlSolução 2.2 0,10 ml 0,10 mlAmostra ---- 0,20 mlÁgua bidestilada 2,00 ml 1,80 mlSolução 2.3 0,02 ml 0,02 ml.

Misturar; após cerca de 5 min. ler as absorvências das soluções testemunha e de doseamento (A1).

Juntar:Solução 2.4 0,02 ml 0,02 ml.

Misturar; esperar o fim da reacção (cerca de 5 minutos) e ler as absorvências das soluções testemunha e de doseamento (A2).

Determinar as diferenças de absorvências (A1 A2) da testemunha e da solução de doseamento.

Deduzir a diferença de absorvências da testemunha da diferença de absorvências do doseamento.DA = DAD DAT

Nota: O tempo necessário à acção das enzimas pode variar de lote para lote; o que foi mencionado anteriormente foi-o apenas a título indicativo. Recomenda-se a sua determinação para cada lote.6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

O teor em ácido cítrico é dado em miligramas por litro (mg/l), sem decimais.6.1. Modo de cálculo

A concentração em miligramas por litro é dada pela fórmula geral:
V = volume do teste em ml (neste caso 3,14 ml)v = volume da amostra em ml (neste caso 0,2 ml)P.M. = massa molecular da substância a dosear (neste caso ácido cítrico anidro = 192,1)d = trajecto óptico da cuba em cm (neste caso 1 cm)e = coeficiente de absorção do NADH a 340 nm,e = 6,3 mmole 1. l.cm 1.

Obtém-se:C = 479 · DA.

Se uma diluição tiver sido efectuada aquando da preparação da amostra, multiplicar o resultado pelo factor de diluição.

Nota:a 334 nm : C = 488 · DA ( = 6,2 mmole 1 · l · cm 1)a 365 nm : C = 887 · DA ( = 3,4 mmole 1 · l · cm 1)6.2. Repetibilidade (r)

Teor em ácido cítrico inferior a 400 mg/l : r = 14 mg/l.Teor em ácido cítrico superior a 400 mg/l : r = 28 mg/l.6.3. Reprodutibilidade (R)

Teor em ácido cítrico inferior a 400 mg/l : R = 39 mg/l.Teor em ácido cítrico superior a 400 mg/l : R = 65 mg/l.


18. ÁCIDO LÁCTICO 1. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS

1.1. Método de referência

Em presença do nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD), o ácido láctico total (L-lactato e D-lactato) é oxidado em piruvato numa reacção catalizada pelas L-lactato desidrogenase (L-LDH) e D-lactato desidrogenase (D-LDH).

O equilíbrio da reacção é em favor do lactato. A eliminação do piruvato do meio de reacção desloca o equilíbrio no sentido da formação de piruvato.

Em presença de L-glutamato, o piruvato é transformado em L-alanina, reacção que é catalizada pela glutamato-piruvato-transaminase (GPT).(1) L-lactato + NAD+ piruvato + NADH + H+(2) D-lactato + NAD+ piruvato + NADH + H+(3) Piruvato + L-glutamato L-alanina + a-cetoglutarato

A formação de NADH, medida pelo aumento da absorvência no comprimento de onda de 340 nm, é proporcional à quantidade de lactato presente.

Nota: O ácido L-láctico pode ser determinado individualmente pela aplicação das reacções (1) e (3).

O ácido D-láctico pode ser determinado individualmente pela aplicação das reacções (2) e (3).1.2. Método usual

Após separação do ácido láctico numa coluna de resina permutadora de aniões, este composto é oxidado em etanal e doseado por colorimetria após reacção com o nitroprussiato de sódio e a piperidina.2. MÉTODO DE REFERÊNCIA

2.1. Reagentes

2.1.1. Solução tampão pH 10 (glicilglicina 0,6 mole/l; L-glutamato 0,1 mole/l)

Dissolver 4,75 g de glicilglicina, 0,88 g de ácido L-glutâmico em cerca de 50 ml de água bidestilada; ajustar o pH a 10 com alguns mililitros de solução de hidróxido de sódio 10 M e acertar a 60 ml com água bidestilada. A solução permanece estável durante pelo menos 12 semanas a +4 °C.

2.1.2. Solução de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD) cerca de 40 · 10 3 M. Dissolver 900 mg de NAD em 30 ml de água bidestilada. A solução permanece estável durante pelo menos 4 semanas a + 4 °C.

2.1.3. Suspensão de glutamato-piruvato-transaminase (GPT) a 20 mg/ml

A suspensão é estável durante pelo menos um ano a + 4 °C.

2.1.4. Suspensão de L-lactato-desidrogenase (L-LDH) a 5 mg/ml

A suspensão é estável durante pelo menos um ano a + 4 °C.

2.1.5. Suspensão de D-lactato-desidrogenase (D-LDH) a 5 mg/ml

A suspensão é estável durante pelo menos um ano a + 4 °C.

É aconselhável proceder, antes do doseamento, à verificação da actividade da enzima.


Nota: O conjunto dos reagentes necessários para este doseamento está comercializado.2.2.Aparelhagem

2.2.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medições a 340 nm, máximo de absorção de NADH

Na sua ausência, fotómetro de espectro descontínuo que permita efectuar medições a 334 nm ou a 365 nm.

Dado tratar-se de medições absolutas de absorvência (sem série de calibragens, mas com referência ao coeficiente de extinção do NADH), as escalas dos comprimentos de onda e das absorvências do aparelho devem ser controladas.

2.2.2. Cubas de vidro de 1 cm de trajecto óptico ou cubas de utilização única

2.2.3. Micropipetas que permitam recolher volumes compreendidos entre 0,02 e 2 ml2.3. Preparação da amostra

Evitar tocar com os dedos nos vidros que entram em contacto com o meio de reacção, dado que tal poderá provocar um aumento de ácido L-láctico que falsearia os resultados.

De um modo geral, o doseamento do lactato é efectuado directamente no vinho sem descoloração prévia e sem diluição, quando a concentração em ácido láctico for inferior a 100 mg/l. Se a concentração do vinho em ácido láctico for compreendida entre:100 mg/l e 1 g/l - diluir 1/10 com água bidestilada;1 g/l e 2,5 g/l - diluir 1/25 com água bidestilada;2,5 g/l e 5 g/l - diluir 1/50 com água bidestilada.2.4. Modo operatório

2.4.1. Doseamento do ácido láctico total

A solução-tampão deve estar com uma temperatura entre 20-25 °C antes de se proceder ao doseamento.

Dado o espectrofotómetro ser regulado no comprimento de onda de 340 nm, as medições da absorvência são feitas em cubas de 1 cm de trajecto óptico, sendo a absorvência zero regulada em relação ao ar (sem cuba no trajecto óptico) ou em relação à água.

Nas cubas de 1 cm de trajecto óptico, introduzir:

Testemunha DosagemSolução 2.1.1 1,00 ml 1,00 mlSolução 2.1.2 0,20 ml 0,20 mlÁgua bidestilada 1,00 ml 0,80 mlSuspensão 2.1.3 0,02 ml 0,02 mlAmostra - 0,20 ml

Misturar com a ajuda de um agitador de vidro ou de uma vareta em matéria sintética com extremidade plana; após cerca de 5 min., medir as absorvências das soluções testemunha e de doseamento (A1).

Juntar 0,02 ml de solução 2.1.4 e 0,05 ml de solução 2.1.5, homogeneizar, esperar o final da reacção (cerca de 30 min.) e medir as absorvências das soluções testemunha e de doseamento (A2).

Determinar as diferenças de absorvência (A2 A1) da testemunha e do doseamento.

Deduzir a diferença de absorvência da testemunha da diferença de absorvência do doseamento.


DA = DAD DAT.2.4.2. Doseamento do ácido L-láctico e do ácido D-láctico

O doseamento do ácido L-láctico e ácido D-láctico pode ser efectuado individualmente aplicando a técnica indicada para o ácido láctico total, desde que A1 tenha sido previamente determinado:

Juntar 0,02 ml da solução 2.1.4, homogeneizar, esperar o final da reacção (aproximadamente 20 min.) e medir as absorvências das soluções testemunha e de doseamento (A2).

Adicionar 0,05 ml da solução 2.1.5, homogeneizar, esperar o fim da reacção (cerca de 30 min.) e medir as absorvências das soluções testemunha e de doseamento (A3).

Determinar as diferenças de absorvência (A2 A1) para o ácido L-láctico e (A3 A2) para o ácido D-láctico no caso da testemunha e no caso do doseamento.

Deduzir a diferença de absorvência da testemunha da diferença de absorvência do doseamento.

DA = DAD DAT.

Nota: O tempo necessário à acção das enzimas pode variar de lote para lote; o tempo mencionado anteriormente apenas o foi a título indicativo. Recomenda-se a sua determinação para cada lote. Quando se doseia apenas o ácido L-láctico, o tempo de incubação após a adição da L-lactato desidrogenase pode ser alterado para 10 minutos.2.5. Expressão dos resultados

A concentração de ácido láctico é dada em gramas por litro (g/l) com 1 decimal.2.5.1. Modo de cálculo

A concentração em gramas por litro é calculada pela fórmula geral:V = volume do teste em ml (V = 2,24 ml para o ácido L-láctico, V = 2,29 ml para o ácido D-láctico e o ácido láctico total)v = volume da amostra em ml (neste caso 0,2 ml)PM = massa molecular da substância a dosear (neste caso DL láctico = 90,08)d = trajecto óptico da cuba em cm (neste caso 1 cm)e = coeficiente de absorção do NADH a 340 nme = 6,3 (mmole 1 · l · cm 1).2.5.1.1. Ácido láctico total e ácido D-láctico

C = 0,164 · DA.

Se foi efectuada uma diluição aquando da preparação da amostra, multiplicar o resultado pelo factor de diluição.

Nota:Medição a 334 nm : C = 0,167 · DA (e = 6,2 mmole 1 · l · cm 1).Medição a 365 nm : C = 0,303 · DA (e = 3,4 mmole 1 · l · cm 1).
2.5.1.2. Ácido L-láctico

C = 0,160· DA.

Se foi efectuada uma diluição aquando da preparação da amostra, multiplicar o resultado pelo factor de diluição.

Nota:Medição a 334 nm : C = 0,163 · DA (e = 6,2 mmole 1 · l · cm 1).Medição a 365 nm : C = 0,297 · DA (e = 3,4 mmole 1 · l · cm 1).2.5.2. Repetibilidade (r)

r = 0,02 + 0,07 xl g/l

xl = concentração de ácido láctico da amostra em g/l.2.5.3. Reprodutibilidade (R)

R = 0,05 + 0,125 xl g/l

xl = concentração de ácido láctico da amostra em g/l.3. MÉTODO USUAL

3.1.1. Para o tratamento preliminar do vinho

Reportar-se ao capítulo «Ácido Tartárico», método usual, em 3.1.1.3.1.2. Para o doseamento do ácido láctico

3.1.2.1. Solução 0,1 M de sulfato de cério IV em ácido sulfúrico 0,35 M

Dissolver, a frio, 40,431 g de sulfato de cério IV, Ce (SO4)2, 4H2O, em 350 ml de uma solução M de ácido sulfúrico exactamente titulada (3.1.2.4). Levar o volume a 1 000 ml com água destilada.

3.1.2.2. Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2,5 M

3.1.2.3. Solução de acetato de sódio a 270 g por litro (preparada a partir de acetato de sódio seco, Na CH3 COO)

3.1.2.4. Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 1 M

3.1.2.5. Solução de nitroprussiato de sódio [Na2 (Fe (CN)5NO), 2H2O] a 2 p. 100 (m/v)

Conservar o frasco bem fechado e ao abrigo da luz.
Limite de conservação da solução: 8 dias.

3.1.2.6. Solução de piperidina (C5 H11 N) a 10 p. 100 (v/v)

3.1.2.7. Solução de ácido láctico M

Diluir 100 ml de ácido láctico (C3H6O3) em 400 ml de água. Esta solução, colocada numa cápsula, é aquecida num banho de água fervente durante 4 horas, sendo o volume completado, de tempos a tempos, com água destilada. Levar o volume a 1 litro após arrefecimento. Titular o ácido láctico existente em 10 ml desta solução com uma solução de hidróxido de sódio M (3.1.2.8). Ajustar a solução a 1 M de ácido láctico (90 g).

3.1.2.8. Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M
3.2. Aparelhagem

3.2.1. Coluna de vidro de, aproximadamente, 300 mm de comprimento e 10-11 mm de diâmetro interno, munida de um regulador de débito (torneira)

3.2.2. Banho de água termostatizado a 65 °C

3.2.3. Espectrofotómetro que permita medições de absorvência no comprimento de onda de 570 nm com cubas de 1 cm de trajecto óptico3.3. Modo operatório

3.3.1. Preparação da coluna permutadora de iões

Ver capítulo «Ácido tartárico», método usual, em 3.3.1.3.3.2. Isolamento dos ácidos orgânicos

Reportar-se ao capítulo «Ácido tartárico», método usual, em 3.3.2.3.3.3. Doseamento do ácido láctico

Introduzir 10 ml de eluído num tubo de vidro de 50 ml de capacidade munido de rolha esmerilada e juntar 10 ml de solução de sulfato de cério (3.1.2.1). Agitar; colocar o tubo num banho de água com termóstato, a 65 °C, durante exactamente 10 minutos. No momento da imersão, retirar durante alguns segundos a rolha de vidro, de modo a compensar a pressão devido ao aquecimento, e, em seguida, voltar a fechar hermeticamente, de forma a evitar perdas do etanal formado. Retirar o tubo, arrefecer sob fluxo de água para obter uma temperatura próxima de 20 °C, juntar 5 ml da solução de hidróxido de sódio 2,5 M (3.1.2.2), misturar e filtrar.

Recolher 15 ml de filtrado, deitá-los num balão de 50 ml, com rolha esmerilada, que contenha já uma mistura homogénea de 5 ml de solução de acetato de sódio a 27 p. 100 (3.1.2.1), e de 2 ml de ácido sulfúrico M (3.1.2.4). Juntar 5 ml da solução de nitroprussiato de sódio (3.1.2.5), misturar, adicionar 5 ml da solução de piperidina (3.1.2.6), misturar com rapidez e introduzir imediatamente esta solução na cuba do espectrofotómetro. A coloração produzida, que varia do verde ao violeta, é medida a 570 nm em relação ao ar (sem cuba no trajecto óptico). Esta coloração aumenta, para diminuir em seguida rapidamente.

Seguir a evolução da absorvência correspondente e escolher como valor definitivo o seu valor máximo.

Se o eluído for demasiado rico em ácido láctico e a absorvência demasiado elevada, diluir o eluído com a solução de sulfato de sódio a 7,1p. 100 (3.1.1) e proceder à medição na solução diluída.3.3.4. Determinação da curva de calibração

Introduzir 10 ml da solução de ácido láctico 1 M (3.1.2.7) e 10 ml de solução titulada de hidróxido de sódio 1 M (3.1.2.8) num balão graduado de 1 000 ml até ao traço com a solução de sulfato de sódio a 7,1 p. 100 (3.1.1). Recolher, em balão, 5, 10, 15, 20 e 25 ml e introduzilos em balões graduados de 100 ml. Completar até ao traço de referência com a solução de sulfato de sódio a 7,1 p. 100. Recolher 10 ml das soluções assim obtidas e determinar para cada uma o valor da absorvência, de acordocom a técnica descrita em 3.3.3 para o eluído.

Estas soluções correspondem aos eluídos obtidos a partir de vinhos que contenham 0,45 - 0,90 - 1,35 - 1,80 e 2,25 g/l de ácido láctico.

A representação gráfica das absorvências destas soluções, em função do teor de ácido láctico, é uma recta.
3.4. Expressão dos resultados

A partir da absorvência medida para o eluído, e utilizando a curva de calibração, obtém-se o teor de ácido láctico do vinho, expresso em gramas por litro.

Este teor é expresso com 1 decimal.

Nota: Os vinhos que contêm mais de 250 mg/l de dióxido de enxofre podem apresentar um teor de ácido etanalsulfónico que é contabilizado como ácido láctico. Neste caso, é necessário corrigir o resultado do doseamento pelo obtido pela seguinte operação complementar: numa proveta com rolha esmerilada são misturados 15 ml de eluído com 5 ml de acetato de sódio a 27 p. 100 (3.1.2.3) e 2 ml de H2SO4 0,775 M (77,5 ml de H2SO4 M são completados, até 100 ml, com água destilada). Seguidamente, tal como no doseamento do ácido láctico, adicionam-se 5 ml de nitroprussiato de sódio (3.1.2.5) a 2p. 100 e 5 ml de piperidina a 10 p. 100 (3.1.2.6). Depois de ter misturado, medir a absorvência nas condições descritas para o doseamento de ácido láctico. A partir desta absorvência, utilizar a curva de calibração para obter o valor aparente B de ácido láctico, expresso em gramas por litro, devido ao ácido etanalsulfónico. Se L' for o teor aparente de ácido láctico do vinho, em gramas por litro, o teor real L de ácido láctico é obtido pela fórmula:

L = L' B · 0,4 (g/l).


19. ÁCIDO L-MÁLICO 1. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Em presença do nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD) o ácido L-málico (L-malato) é oxidado em oxaloacetato numa reacção catalizada pela L-malato desidrogenase (L-MDH).

O equilíbrio da reacção é a favor do malato. A eliminação do oxaloacetato do meio de reacção desloca o seu equilíbrio no sentido da formação de oxaloacetato. Em presença de L-glutamato, o oxaloacetato é transformado em L-aspartato, reacção que é catalizada pela glutamato-oxaloacetato-transminase (GOT).

(1) L-malato + NAD+ L-MDH oxaloacetato + NADH + H+

(2) Oxaloacetato + L-glutamato GOT L-aspartato + a-cetoglutarato

A formação de NADH, medida pelo aumento da absorvência no comprimento de onda de 340 nm, é proporcional à quantitade de L-malato presente.2. REAGENTES

2.1. Tampão pH 10
(Glicilglicina 0,60 M, L-glutamato 0,1 M)

Dissolver 4,75 g de glicilglicina e 0,88 g de ácido L-glutâmico em cerca de 50 ml de água bidestilada; ajustar o pH a 10 com aproximadamente 4,6 ml de solução de hidróxido de sódio 10 M e completar o volume a 60 ml com água bidestilada.A solução permanece estável durante pelo menos 12 semanas a + 4 C.

2.2. Solução de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD), cerca de 47 · 10 3 M

Dissolver 420 mg de NAD em 12 ml de água bidestilada. A solução permanece estável durante pelo menos 4 semanas a + 4 C.

2.3. Suspensão de glutamato-oxaloacetato-transaminase (GOT) a 2 mg/ml

A suspensão é estável durante pelo menos um ano a + 4 C.

2.4. Solução de L-malato-desidrogenase (L-MDH) a 5 mg/ml

A solução é estável durante pelo menos um ano a + 4 C.

Nota: O conjunto dos reagentes necessários para este doseamento estão comercializados.3. APARELHAGEM

3.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medições a 340 nm, máximo de absorção do NADHNa sua ausência, fotómetro de espectro descontínuo que permita efectuar medições a 334 nm ou a 365 nm.

Dado tratar-se de medições absolutas de absorvência (sem série de calibragens, mas com referência ao coeficiente de extinção do NADH), as escalas dos comprimentos de onda e das absorvências do aparelho devem ser controladas.

3.2. Cubas de vidro de 1 cm de trajecto óptico ou cubas de utilização única

3.3. Micropipetas que permitam recolher volumes compreendidos entre 0,01 e 2 ml4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

De um modo geral, o doseamento do L-malato é efectuado directamente no vinho sem descoloração prévia e sem diluição, desde que o teor em ácido L-málico seja inferior a

350 mg/l (medição a 365 nm). Caso contrário, proceder à diluição do vinho com água bidestilada, de modo a que a concentração de L-malato se situe entre 30 e 350 mg/l (quantidade de L-malato na toma de ensaio compreendida entre 3 e 35 µg).

Se a concentração em malato no vinho for inferior a 30 mg/l, o volume da toma de ensaio pode ser aumentado até 1 ml. Neste caso, o volume de água a juntar é reduzido de modo a que os volumes totais sejam os mesmos nas duas cubas.5. MODO OPERATÓRIO

Dado que o espectrofotómetro é regulado no comprimento de onda de 340 nm, as medições de absorvência são feitas em cubas de 1 cm de trajecto óptico, sendo a absorvência zero regulada em relação ao ar (sem cuba no trajecto óptico) ou em relação à água.

Nas cubas de 1 cm de trajecto óptico introduzir:

Testemunha DoseamentoSolução 2.1 1,00 ml 1,00 mlSolução 2.2 0,20 ml 0,20 mlÁgua bidestilada 1,00 ml 0,90 mlSuspensão 2.3 0,01 ml 0,01 mlAmostra - 0,10 ml.

Misturar; após cerca de 3 min., medir as absorvências das soluções testemunha e de doseamento (A1).

Juntar:Solução 2.4 0,01 ml 0,01 ml.

Misturar; esperar o final da reacção (cerca de 5 a 10 min.) e medir as absorvências das soluções testemunhas e doseamento (A2).

Determinar as diferenças de absorvência (A2 A1) da testemunha e do doseamento.

Deduzir a diferença de absorvência da testemunha da diferença de absorvência do doseamento.

DA = DAD DAT.

Nota: O tempo necessário à acção das enzimas pode variar de um lote para outro; o tempo que foi mencionado anteriormente apenas o foi a título indicativo. Recomenda-se a sua determinação para cada lote.6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

A concentração de ácido L-málico é dada em gramas por litro (g/l) com 1 decimal.6.1. Modo de cálculo

A concentração em gramas por litro é calculada pela fórmula geral:V = volume do teste em ml (neste caso 2,22 ml)v = volume da amostra em ml (neste caso 0,1 ml)PM = massa molecular da substância a dosear (neste caso ácido L-málico = 134,09)d = trajecto óptico da cuba em cm (neste caso 1 cm)
e = coeficiente de absorção do NADH, a 340 nm e = 6,3 mmole 1 · l · cm 1.

Obtem-se para o L-malato:C = 0,473 · DA g/l.

Se foi efectuada uma diluição aquando da preparação da amostra, multiplicar o resultado pelo factor de diluição.

Nota:medição a 334 nm C = 0,482 x DA
medição a 365 nm C = 0,876 x DA.6.2. Repetibilidade (r)

r = 0,03 + 0,034 xi
xi = concentração em ácido málico da amostra, em g/l.6.3. Reprodutibilidade (R)

R = 0,05 + 0,071 xi
xi = concentração em ácido málico da amostra em g/l.


20. ÁCIDO D-MÁLICO (método enzimático) TESTE - COMBINAÇÃO PARA CERCA DE 30 DETERMINAÇÕES1. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Em presença do D-malato-desidrogenase-dexcarboxil (D-MDH), o ácido D-málico (D-malato) é oxidado em oxaloacetato pela nicotinamida-adenina-dinucleótido (MAD). O oxaloacetato formado é transformado em piruvato e ácido carbónico.

D-malato + NAD+ D MDH + piruvato + CO2 + NADH + H¹

A formação de NADH, medido pelo aumento de absorvência no comprimento de onda de 334, 340 e 365 nm é proporcional à quantidade de D-malato presente.2. COMPOSIÇÃO DO COFRE (KIT)

a) Frasco 1, contendo cerca de 30 ml de solução-tampão Hepes, 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetano-ácido sulfónico) pH = 9,0 e estabilizadoresb) Frasco 2, contendo cerca de 210 mg de lidofilisado-NADc) Três frascos 3, contendo o liofilisado de D-MDH, cada um com cerca de 8 U.2.1.Preparação das soluções

2.1.1. Utilizar o conteúdo do frasco 2.a) sem diluição. Termostatizar as soluções a 20-25 °C antes do seu emprego.

2.1.2. Dissolver o conteúdo do frasco 2.b) em 4 ml de água bidestilada.

2.1.3. Dissolver o conteúdo de um dos frascos 2.c) em 0,6 ml de água bidestilada. Termostatizar a solução a 20-25 °C antes do seu emprego.2.2. Estabilidade das soluções

O conteúdo do frasco 2.1.1 conserva-se pelo menos um ano a + 4 °C. A solução 2.1.2 conserva-se cerca de 3 semanas a + 4 °C e 2 meses a 20 °C.A solução 2.1.3 conserva-se 5 dias a + 4 °C.3. APARELHAGEM

3.1. Espectrofotómetro permitindo que se efectuem as leituras a 340 nm, máximo de absorção do NADH e do NADPHNa sua falta, utilizar um fotómetro de espectro descontínuo que permita efectuar as leituras a 334 nm ou a 365 nm.

3.2. Cubas de vidro de 1 cm de trajecto óptico ou cubas de utilização única

3.3. Micropipetas que permitam tomas de volumes compreendidos entre 0,01 e 2 ml4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

A quantidade de D-malato na cuba deve estar compreendida entre 2 µg e 50 µg. Diluir, portanto, a solução de ensaio de tal forma que a concentração em malato esteja compreendida entre 0,02 e 0,5 g/l resp. 0,02 e 0,3 g/l.

Se a diferença de absorção D A é < 0,100, o volume do ensaio pode ser aumentado até 1,80 ml, reduzindo o volume de água a adicionar, a fim de que os volumes totais sejam os mesmos nas duas cubas (ensaio e testemunha).
5. MODO OPERATÓRIO

Temperatura: 20 a 25 °CVolume do teste: 2,95 ml

Leitura contra o ar (sem cuba no trajecto óptico) ou contra a água.


Introduzir nas cubasTestemunhaEnsaioSolução 2.1.11,00 ml1,00 mlSolução 2.1.20,10 ml0,10 mlÁgua bidestilada1,80 ml1,70 mlEnsaio 0,10 mlMisturar. Cerca de 6 min. depois, ler as absorvências das soluções (A1). Desencadear a reacção por adição de:Solução 2.1.30,05 ml0,05 mlMisturar. No fim da reacção (cerca de 20 mn.), ler as absorvências das soluções (A2).

Determinar as diferenças de absorvências (A2 A1), do testemunho e do ensaio. Deduzir a diferença de absorvência da testemunha da do ensaio.D A = D Ae D At.6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

A concentração em ácido D-málico é dada em gramas por litro (g/l) com 1 decimal.6.1. Modo de cálculo

A fórmula geral para o cálculo das concentrações é a seguinte:V = volume do teste (ml)v = volume do ensaio (ml)PM = peso molecular da substância a doseard = espessura da cuba (cm)e = coeficiente de absorção do NADH

Hg 340 nm = 6,3 (mmole 1 · l · cm 1)Hg 334 nm = 6,18 (mmole 1 · l · cm 1)Hg 365 nm = 3,4 (mmole 1 · l · cm 1).

Obtém-se assim para o D-malatoSe se efectuou uma diluição quando se fez a preparação da amostra, multiplicar o resultado pelo factor de diluição F.
6.2. Repetibilidade (r)

r = 0,05 × Xi

6.3. Reprodutibilidade (R)

R = 0,1 × Xi
Xi = Concentração em ácido D-málico em g/l.

 
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